Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in der Biologie des menschlichen Malariaparasiten P.Falciparum zu beantworten, indem sie hilft, die Proteinfunktion durch bedingten Knockdown aufzudecken. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine relativ einfache Erzeugung von bedingten Mutanten im Vergleich zu früheren Methoden ermöglicht. Um zu beginnen, gehen Sie zu Chop Chop und wählen Sie Fasta Target'Under Target, fügen Sie die 200 Basenpaare aus dem drei Primende des offenen Leserahmens eines Gens und 200 Basenpaare vom Beginn der drei wichtigsten UTR des Gens ein.
Klicken Sie unter In'select P.Falciparum'and select CRISPR/Cas9'under Using'Next auf Zielsites suchen'Wählen Sie eine gRNA-Sequenz aus den vorgestellten Optionen aus, wobei die effizienteste gRNA bevorzugt wird, die dem Ort der Änderung am nächsten ist und die wenigsten Off-Target-Sites hat. Kaufen Sie die gRNA-Sequenz und ihre umgekehrte Komplement als Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese gereinigte Oligos. Die gRNA-Sequenz, die als Ziel für PfH-sp70x verwendet wird, finden Sie im Textprotokoll.
Fügen Sie jeweils 40 Mikrogramm pMK-U6, pUF1-Cas9 und pHA-glmS DNA in ein steriles 1,5-Millimeter-Zentrifugenrohr ein. Fügen Sie ein Zehntel des VOLUMENs der DNA von drei molarem Natriumacetat in Wasser in die Röhre und mischen Sie es gut mit einem Wirbel. Dann fügen Sie das 2,5-fache des Volumens von 100 Prozent Ethanol in die Röhre und mischen Sie es gut mit einem Wirbel für mindestens 30 Sekunden.
Legen Sie die Röhre auf Eis oder bei minus 20 Grad Celsius für 30 Minuten. Dann zentrifugieren Sie das Rohr bei 18, 300 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig aus dem Rohr entfernen, ohne das Pellet zu stören.
Fügen Sie das Dreifache des Volumens von 70 Prozent Ethanol in die Röhre und mischen Sie es kurz mit einem Wirbel. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 18, 300 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand erneut vorsichtig aus dem Rohr, ohne das Pellet zu stören.
Lassen Sie das Rohr offen und lassen Sie das Pellet für 15 Minuten trocknen. Bewahren Sie die gefällte DNA bei minus 20 Grad Celsius auf, bis sie für die Transfektion benötigt wird. Um RBCs zu transfezieren, bereiten Sie 1X Cytomix-Puffer sowie unvollständiges und vollständiges RPMI vor, wie im Textprotokoll beschrieben.
Filter sterilisieren den Puffer mit einem 0,22-Mikron-Filter. Fügen Sie 380 Mikroliter des 1X Zytomixes in die DNA und Wirbel, um sich aufzulösen. Lassen Sie die DNA im 1X Cytomix für 10 Minuten auflösen, wirbeln alle drei Minuten für 10 Sekunden.
In einem sterilen, 15 Milliliter konischen Rohr, kombinieren 300 Mikroliter isolierter menschlicher RBCs im unvollständigen RPMI mit vier Millilitern 1X Cytomix. Zentrifugieren Sie die RBCs bei 870 mal G für drei Minuten. Entfernen Sie dann den Überstand aus dem RBC-Pellet.
Das RBC-Pellet mit dem DNA-Cytomix-Gemisch wieder aufhängen und auf eine 0,2 Zentimeter elektroporationküpation. Bewerten Sie die RBCs anhand der im Textprotokoll aufgeführten Bedingungen. Übertragen Sie den Inhalt nach der Elektroporation von der Küvette auf ein 15 Milliliter konisches Rohr mit fünf Millilitern komplettem RPMI.
Zentrifugieren Sie das Rohr bei 870 mal G für drei Minuten bei 20 Grad Celsius. Dann dekant den Überstand. Nun, setzen Sie das Pellet in vier Milliliter nbiss kompletten RPMI wieder auf und übertragen Sie es auf einen Brunnen in einer Sechs-Brunnen-Gewebekulturplatte.
Fügen Sie 400 Mikroliter einer hochschizont Kultur zu den übertragenen RBCs. Halten Sie alle Kulturen bei 37 Grad Celsius unter drei Prozent Sauerstoff, drei Prozent CO2 und 94 Prozent Stickstoff. Am nächsten Tag waschen Sie die Kultur mit vier Millilitern kompletten RPMI.
Zentrifugieren Sie die Kultur bei 870 mal G für drei Minuten. Aspirieren Sie den Überstand. Setzen Sie die Kultur in vier Millilitern des vollständigen RPMI wieder aus.
48 Stunden später, waschen Sie die Kultur mit vier Milliliter n. Chr. Setzen Sie dann die Kultur in vollständigem RPMI, das ein Mikromolar DSM1 enthält, erneut aus, um für das Cas9-Plasmid auszuwählen. Ersetzen Sie danach das Kulturmedium alle 48 Stunden durch ein komplettes RPMI plus ein Mikromolar DSM1.
Waschen Sie die Kulturen jeden Tag mit komplettem RPMI, bis Parasiten nicht mehr durch Blutabstrich eimpern sichtbar sind. Um einen Blutabstrich zu machen, Pipette 150 Mikroliter Kultur in eine 0,6 Milliliter Zentrifugenröhre. Nachdem Sie die Zellen 30 Sekunden lang durch Zentrifugieren bei 1, 700 mal G pelletiert haben, den Überstand absaugen.
Verwenden Sie eine Pipette, um die pelletierten Zellen auf eine Glasrutsche zu übertragen. Mit einer zweiten Glasrutsche in einem 45-Grad-Winkel zur ersten Rutsche, schmieren Sie das Bluttröpfchen. Färben Sie die Folie mit einem handelsüblichen Färbeset nach dem Herstellerprotokoll.
Sehen Sie sich die Parasiten mit dem 100-fachen Öl-Immersion-Objektiv an. Ab fünf Tagen nach der Transfektion, entfernen Sie zwei Milliliter der Kultur mit RBCs wieder im Kulturmedium ausgesetzt. Fügen Sie zwei Milliliter frisches Medium und Blut bei zwei Prozent Hämatokrit hinzu.
Fügen Sie frisches Blut auf diese Weise einmal pro Woche, bis Parasit wieder auftauchen, wie durch dünne Blutabstrich bestimmt. Führen Sie serielle Verdünnungen der Parasitenkultur durch, um eine endgültige Konzentration von 0,5 Parasiten pro 200 Mikroliter zu erreichen. Fügen Sie 200 Mikroliter der verdünnten Kultur in die Brunnen einer 96-Well-Gewebekulturplatte.
Bewahren Sie die Klonplatte auf, bis Parasiten in den Brunnen nachweisbar sind. Alle 48 Stunden das Medium in der 96-Well-Platte durch frisches Medium ersetzen. Einmal pro Woche, beginnend fünf Tage nach Beginn der Klonplatte, entfernen Sie 100 Mikroliter aus jedem Brunnen und fügen Sie 100 Mikroliter frisches Medium plus Blut hinzu.
Um parasitenhaltige Brunnen zu identifizieren, legen Sie die 96-Well-Platte etwa 20 Minuten lang in einem 45-Grad-Winkel, damit sich das Blut in einem Winkel innerhalb der Platte absetzen kann. Dann legen Sie die 96-Well-Platte auf einen Leuchtkasten. Beachten Sie, dass die Brunnen, die Parasiten enthalten, Medien enthalten, die gelb sind, im Vergleich zu den rosa Medien von parasitenfreien Brunnen, aufgrund der Versauerung des Mediums durch die Parasiten.
Mit einer serologischen Pipette bewegen Sie den Inhalt der parasitenhaltigen Brunnen auf eine 24-Well-Gewebekulturplatte, um eine Ausdehnung der Parasitenzulage zu ermöglichen. Überprüfen Sie mithilfe der PCR-Analyse diese klonalen Parasitenlinien auf eine korrekte Integration. Die Ergebnisse eines Immunfluoreszenz-Assays werden hier gezeigt, was die erfolgreiche HA-Kennzeichnung von PfH-sp70x zeigt.
PfH-sp70x glmS Parasiten wurden fixiert und mit DAPI als Kernmarker sowie Antikörpern gegen HA gefärbt. Membranassoziiertes Histidin reiches Protein eins, ein Marker des Proteinexports zum Wirt RBC. Eine Western Blot-Analyse des PfH-sp70x-Proteinspiegels nach der Behandlung mit Glucosamin wird hier gezeigt. Wie erwartet sinkt der Proteinspiegel während der Behandlungsdauer.
Diese Technik ebnet forschern auf dem Gebiet der Parasitologie den Weg, grundlegende Fragen in der Biologie des Malariaparasiten zu untersuchen. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass P.Falciparum ein blutübertragener Erreger ist und geeignete persönliche Schutzausrüstung während der Durchführung dieses Verfahrens getragen werden sollte.
