يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في اكتشاف المبيدات الحشرية وحقول مكافحة النواقل. مثل، ما مدى سمية الكيمياء غير المُهمَّلة للسكان من يرقات البعوض أو البالغين؟ هل الكيمياء لديها إمكانية للتطور كمبيد للرفان أو قتل للبالغين؟
وما هو أكثر طرق التسليم فعالية؟ المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها لتقييم سمية الكيمياء غير المُعدة سمية الكيمياء ضد أنواع متعددة من البعوض الناقل ، ويمكن توسيع نطاقها بحيث تبلغ قيمة مئات المركبات في سعة إنتاجية عالية. إثبات الإجراء سيكون جاسلين كاور، فني علمي من مختبري.
للبدء، تسمية آبار لوحة ثقافة الأنسجة 24-جيدا. استخدام توازن تحليلي لوزن مركب الاختبار. ثم، desolve المجمع في الماء المقطر مزدوجة العقيمة في أنبوب 1.5mL، مما أدى إلى حل الأسهم 80m.
المقبل، بشكل تسلسلي تخفيف محلول المخزون باستخدام المياه المقطرة مزدوجة لإعداد حلول المخزون العمل من التركيزات المطلوبة. لاحظ أنه يجب أن يؤخذ الحذر تضاف اليرقات إلى الآبار ، أثناء إزالة المياه الزائدة ، وعندما يتم إضافة الكيمياء الاختبارية لتجنب الضرر المادي لليرقات. قد تؤدي الإصابة إلى زيادة معدل الوفيات، وبالتالي تؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة أو تبطل الفحص.
استخدام ماصة نقل البلاستيك تتحمل واسعة لنقل خمس يرقات النجوم الثالثة إلى كل بئر من لوحة. ثم، استخدم ماصة مل واحد لإزالة الماء بلطف، واستبدالها بالحجم المطلوب من الماء المقطر المزدوج. احرص على عدم لمس اليرقات عند إزالة المياه بسرعة لضمان عدم اتضاء اليرقات ، وإضافة كيمياء الاختبار بلطف عن طريق الأنابيب على الجانب الآخر من البئر البلاستيكية.
إضافة حجم مناسب من حل الاختبار لكل بئر، وبلطف تدوير لوحة لضمان خلط موحد. ضع اللوحة في غرفة النمو التي تحافظ على 12 ساعة دورة خفيفة / داكنة عند 25 درجة مئوية مع 75 إلى 85 في المئة الرطوبة النسبية. للتحقق من حركة اليرقات، اضغط بلطف على الطبق.
إذا لم يتم ملاحظة أي حركة ، المس اليرقة بلطف باستخدام مسواك معقمة. تسجيل اليرقة على أنها ميتة إذا لم يتم ملاحظة أي استجابة ، واستخدام ورقة نقاط لتسجيل العدد الإجمالي لليرقات الميتة في كل بئر ، في النقاط الزمنية الموضحة في بروتوكول النص. ثقافة ثلاثة إلى خمسة أيام من العمر البعوض الإناث البالغ في قفص بلاستيكي 20 لتر.
تسمية تسعة أكواب ورقة أوقية مع اسم وتركيز مجمع الاختبار. المقبل, إعداد 10mg/مل حل الأسهم من مجمع اختبار في الأسيتون في قارورة الزجاج 20mL. ثم، بشكل متسلسل تخفيف حل المخزون للحصول على تركيزات العمل المطلوب.
تنظيف حقنة زجاجية mL واحد مع الأسيتون. ثم تعبئة مع حل اختبار في التركيز المناسب. تأمين الحقنة في تطبيق صغير تعديل لتسليم حجم 0.25uL.
بعد ذلك ، استخدم جهاز pirator لإزالة 10 ، ثلاثة إلى خمسة أيام من البعوض الإناث البالغات من القفص. تخديرهم لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. ثم نقل البعوض إلى طبق بتري.
ضع الطبق على الجليد لمدة 10 دقائق. من أجل تجنب إتلاف البعوض البالغ ، الذي يمكن أن يساهم في الوفيات ، تأكد من عدم تخديرها في الثلاجة لأكثر من خمس دقائق ، أو شل حركتها على الجليد لأكثر من 10 ، وتقليل التعامل مع البعوض. إذا كان لديك إمكانية الوصول إلى لوحة باردة ، وmicromanipulator مع مرحلة منقولة ، التي قد تقلل من التعامل مع البعوض.
استخدم ملاقط دقيقة لإزالة كل بعوضة من الطبق. مع حقنة صغيرة applicator تطبيق 0.25uL من حل الاختبار إلى الصدر الظهرية، تحت مجهر تشريح التالي، ونقل البعوض إلى كوب ورقة المسمى على الجليد. ختم الكأس مع مربع شبكة 10 في 10cm وشريط مطاطي ثم، نقله إلى غرفة النمو، وتسجيل عدد البعوض الميت كما وصف سابقا.
جمع ما يقرب من 150 أربعة إلى خمسة أيام من البعوض الإناث البالغين مع pirator، ونقلها إلى قفص منفصل. إزالة مصدر السكر ساعة إلى 24 ساعة قبل فحص التغذية. إعداد محلول مخزون 80m من مجمع الاختبار في الماء.
ثم، تخفيفه بشكل متسلسل بالماء، للحصول على حلول المخزون العامل من التركيزات المطلوبة. للحصول على تركيزات الاختبار المطلوبة، إضافة 40uL من كل تخفيف إلى 960uL من الدم أرنب مذاب في أنبوب 1.5mL، ومزيج عن طريق الأنابيب. ضع فلتر عضو على وحدة التغذية وختمه بحلقة مطاطية.
بعد ذلك، استخدم ماصة لنقل مل واحد من الدم مع محلول الاختبار من خلال منفذ التسليم، وتقع على الجانب العكسي من وحدة التغذية. قم بتوصيل وحدة التغذية إلى وحدة التدفئة. ثم، مسحة سطح الغشاء بلطف مع الطازجة أعدت 10 في المئة محلول حمض اللبنيك.
ضع وحدة التغذية في القفص. غطي القفص بقطعة قماش داكنة، واسمح للبعوض بالأعلاف لمدة ساعة واحدة. بعد تغذية البعوض ، ضع القفص في الثلاجة عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق ل التخدير.
ثم، عد وتسجيل العدد الإجمالي للبعوض في القفص. من خلال فحص البطن ، عد وتسجيل العدد الإجمالي للبعوض الإناث التي تتغذى بشكل كامل وجزئي. وينبغي الحصول على ما لا يقل عن 50 من البعوض الذي يتغذى على الدم لكل جرعة.
إزالة أي البعوض التي لم تتغذى. بعد ذلك ، نقل القفص إلى غرفة النمو ، واستخدام ورقة النتيجة لتسجيل عدد البعوض الميت في النقاط الزمنية المناسبة. في اليوم الثالث من التغذية بعد الدم، ضع كوب البيض في القفص لمدة 72 ساعة.
استخدم مجهر تشريح لحساب العدد الإجمالي للبويضات المنتجة لكل علاج. تم إجراء مقايسة اتصال اليرقات لتقييم تأثير الأميتريبتيلين ، وهو خصم مستقبلات الدوبامين ، على وفيات اليرقات بمرور الوقت. وكشفت البيانات أن قيمة LC 50 تنخفض مع مرور الوقت من التجربة.
قورن تأثير الأميتريتيلين على وفيات البعوض الإناث البالغ مع البيفينثرين، واثنين من الضوابط السلبية. بالمقارنة مع الأسيتون المعالجة والضوابط السلبية غير المعالجة, كل من amitriptyline وbifenthrin تسبب في وفيات كبيرة في كل نقطة زمنية تجريبية. تم إجراء فحص التغذية الكمية لتقييم تأثير ثلاث جرعات مختلفة من الأميتريبتيلين على البراز وفي المئة وفيات البعوض الإناث البالغ.
وكشفت البيانات عن عدم وجود فرق ذي دلالة إحصائية في براز البعوض الذي يتغذى على الأميتريبتيلين بأعلى جرعة مقارنة بضوابط التغذية بالدم فقط. مرة واحدة يتقن، أي من المقايسات التي وصفناها هنا، يمكن أن تكتمل في ما يقرب من ساعتين من قبل فرد واحد، إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التعامل بلطف مع الكائن ، ويجب أن يكون هناك اتساق أثناء التطبيقات الموضعية وأثناء تسجيل اليرقات أو فحص البالغين.
بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التحاليل الحيوية لتقييم السمية عن طريق الامتصاص، من خلال الطرسي البعوض، مقايسة زجاجة CDC، ومقايسة أنبوب منظمة الصحة العالمية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بفعالية الكيمياء غير المتشكلة، أو منتج مصاغ، وإمكانية التطوير كمبيد حشري ملامسة أو رذاذ فضائي.
