Este método puede responder preguntas clave en los campos de células madre y cáncer, como cómo se ve la heterogeneidad de las células madre y cómo se puede aislar la terapia en células cancerosas sensibles. La principal ventaja de este estudio es que combina un análisis de expresión génica unicelular técnicamente robusto junto con la vaccinosis para una mayor caracterización posterior de las subpoblaciones diana. Aunque este método se puede utilizar para investigar el cáncer y la heterogeneidad de las células madre, también puede dar información sobre el cebado genético y el potencial de linaje.
Para comenzar el protocolo, en un banco libre de ARN/ADN, preparar suficiente tampón de lisis para 96 pozos con 10% extra mezclando 390 microlitros de agua libre de nucleasas, 17 microlitros de 10%NP-40, 2.8 microlitros 10 dNTP milimolar, 10 microlitros 0.1 molar TDT y 5.3 microlitros inhibidores RNAse. Vórtice y gire por el tubo. A continuación, distribuya cuatro microlitros de tampón de lelisis a cada pozo de una placa PCR de 96 pozos y selle las placas con película adhesiva.
Gire hacia abajo las placas para recoger el líquido en la parte inferior. Mantenga las placas sobre hielo hasta que la célula se clasife durante un máximo de 24 horas. Una vez que la máquina FACS se ha configurado correctamente, realice el reanálisis de la población objetivo clasificando al menos 100 células diana en un nuevo tubo de microcentrífuga con 100 microlitros de tampón de manchas.
FACS analiza las celdas ordenadas registrando la muestra ordenada y asegúrese de que terminan en la puerta de clasificación. A continuación, configure la clasificación de la placa de una sola celda centrando la caída en el pozo A1 en la placa de 96 pozos. Cuando se centra, clasif sino partículas de 50 a 106 micrómetros en todos los pozos alrededor del borde de una placa vacía de 96 pozos para asegurarse de que todos los pozos obtendrán una celda en el centro de cada pozo.
Retire la película adhesiva de las placas. Ordene una sola celda de Lin-CD34 más células CD38 menos en 92 de los 96 pozos. Active la clasificación de índices en el software de clasificación FACS para guardar el perfil inmunofenotípico para CD45RA, CD49F y CD90 para cada célula.
Ordene dos pozos con 10 y 20 celdas respectivamente para controles de linealidad en la amplificación de PCR. Los pozos H1 y H2 se utilizan generalmente. Mantenga dos pozos sin celdas como sin controles de plantilla, por lo general pozos H3 y H4. Selle las placas con una película adhesiva transparente y gire las placas a 300 veces la gravedad durante un minuto.
Enganche las placas sobre hielo seco. A continuación, guárdelos a menos 80 grados centígrados. Haga la transcripción inversa y la mezcla de amplificación de objetivo específica añadiendo 632,5 microlitros de mezcla de reacción de dos veces, 101,2 microlitros Taq/SuperscriptIII, 151,8 microlitros mezcla de imprimación, y 0,7 microlitros pinchados en ARN de control.
Vórtice la solución y gítela hacia abajo para recoger el líquido en la parte inferior del tubo. Mantenga la mezcla sobre hielo hasta que esté lista para ser añadida a la muestra. A continuación, descongele las placas de izado sobre hielo.
Agregue 8,75 microlitros de la transcripción inversa previamente preparada y la mezcla de amplificación de objetivo específica a 92 pozos, incluyendo la linealidad y sin controles de plantilla. Agregue 8,75 microlitros sin mezcla de control de transcripción inversa a los cuatro pozos restantes. A continuación, sellar las placas con película adhesiva transparente y girar las placas para recoger el líquido en la parte inferior.
Realice la transcripción inversa y la amplificación específica del objetivo ejecutando la placa en una máquina PCR de acuerdo con el programa de preamplificador. Prepare la placa de carga del ensayo pipeteando tres microlitros de reactivo de carga de ensayo a cada pozo de una placa de 96 pozos. Agregue tres microlitros de cada imprimación a pozos individuales en la placa de carga del ensayo.
Selle la placa con película adhesiva y gítela hacia abajo. Después de girar la placa, prepare la placa de dilución pipeteando ocho microlitros de agua libre de nucleasa en todos los pozos de una placa de 96 pocillos. Añadir dos microlitros de muestra amplificada a la placa de dilución.
Selle la placa con película adhesiva. Mezclar mediante el vórtice de la placa durante 10 segundos. Luego gira el plato.
A continuación, prepare la mezcla de carga de muestras mezclando cuidadosamente 352 microlitros de mezcla maestra con 35,2 microlitros de reactivo de carga de muestras. Prepare la placa de carga de la muestra alí citando 3,3 microlitros de mezcla de carga a cada pozo de una placa de 96 pozos. Agregue 2,7 microlitros de la muestra diluida en cada pozo de la placa de carga de la muestra.
Selle la placa con película adhesiva y gítela hacia abajo. Saca un nuevo chip microfluídico de 96 por 96. Prepare las entradas clasiéndolas con una jeringa con una tapa puesta para asegurarse de que se pueden mover.
Añada el volumen completo de las jeringas a cada válvula mientras inclina el chip a 45 grados y presiona la válvula. Prepara el chip con el controlador IFC. Cargue cada entrada de ensayo con 4,25 microlitros de cada uno de los pozos en la placa de carga del ensayo y evite las burbujas.
Si aparecen burbujas en el pozo, retírelas con una punta de pipeta. Continúe cargando cada entrada de muestra con 4,25 microlitros de cada uno de los pozos de la placa de carga de la muestra, evitando burbujas, y si aparecen burbujas quitándolas con una punta de pipeta. Cargue el chip con el controlador de circuito de fluidos integrado o el controlador IFC.
Compruebe que el chip se ve uniforme y que todas las cámaras han sido cargadas. Retire el polvo de la superficie del chip tocándolo con cinta adhesiva. Por último, ejecute el chip en la plataforma de expresión génica microfluídica multiplex.
Un mapa de calor de una ejecución exitosa muestra la expresión distribuida uniformemente entre muestras con una señal fuerte de alrededor de siete a 25 TT. Esta curva de amplificación de ARN de control pico verifica que todos los pozos tienen una expresión clara de alrededor de 10 TC con poca o ninguna variación, validando que las reacciones de preamplificación y qPCR habían tenido éxito para todas las células. El análisis de componentes de principios o PCA que visualiza las similitudes entre los grupos de células mediante la reducción de dimensiones puede ser útil para distinguir grupos de células molecularmente distintas entre sí aquí identificando cuatro subgrupos.
Para identificar el inmunofenotipo de células de diferentes grupos moleculares, cargue el archivo FCS de índice en FlowJo. Abra el editor de scripts y pegue el script de índice, presione Ejecutar. Cada celda estará ahora en una puerta separada.
Agregue cada celda al editor de diseño y coloréúcelas de acuerdo con la agrupación definida molecularmente de SCXV disponible en el sample_complete_data.xls de archivo. Las gráficas FACS muestran la expresión del marcador de superficie celular para los marcadores de células madre hematopoyéticas CD90 y CD45RA que se pueden utilizar para discriminar entre los clústeres y aislarlos para el análisis funcional. Después de este procedimiento, se puede realizar otra técnica como la secuenciación de ARN de subpoblaciones recién descubiertas o experimentos in vitro e in vivo para responder a preguntas adicionales como qué mecanismo molecular causa esta heterogeneidad y cómo difiere funcionalmente la subpoblación.
Esta estrategia allanó el camino para que los investigadores no sólo investigaran la heterogeneidad en hematopoyesis normal y maligna, sino que también se puede utilizar para aislar prospectivamente las subpoblaciones descubiertas para seguir estudiándolas.
