この方法は、幹細胞の異質性がどのように見えるか、敏感な癌細胞の治療をどのように分離できるかなど、幹細胞分野やがん分野の重要な質問に答えることができます。この研究の主な利点は、技術的に堅牢な単細胞遺伝子発現解析とバクチノーシスを組み合わせて、標的亜集団のさらなる下流特性化を行う点である。この方法は、癌および幹細胞の不均一性を調べるのに使用することができるが、それはまた、遺伝子のプライミングおよび系統電位に関する洞察を与えることができる。
このプロトコルを開始するには、RNA/DNAフリーベンチで、390マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水、10%NP-40の17マイクロリットル、2.8マイクロリットル10ミリモルdNTP、10マイクロリットル0.1モルDTT、および5.3マイクロリットル阻害剤を混合することによって、10%余分な96ウェルに十分なリシスバッファーを調製します。渦とチューブをスピンダウン。次に、96ウェルPCRプレートのウェルに4マイクロリットルのライシスバッファーを分配し、粘着フィルムでプレートを密封します。
プレートを回転させ、底面の液体を集める。プレートを氷の上に置いておき、セルの並べ替えが最大24時間続くまで保管します。FACSマシンが適切にセットアップされたら、少なくとも100個のターゲットセルを100マイクロセントリフュージチューブに仕分けし、100マイクロリットルの汚れバッファーを持つ新しいマイクロ遠心分離管に選別して、ターゲット集団の再分析を行います。
FACS は、並べ替えられたサンプルを記録して並べ替えられたセルを分析し、並べ替えゲートで終了することを確認します。その後、96ウェルプレートのウェルA1にドロップをセンタリングすることによって、単一セルプレートのソートを設定します。中央に配置されたら、空の96ウェルプレートの端の周りのすべての井戸に50〜106マイクロメートルの粒子をソートし、すべての井戸が各ウェルの中央に細胞を得ることを保証します。
プレートから粘着フィルムを取り除きます。Lin-CD34とCD38マイナスセルの単一のセルを96個のウェルのうち92個に並べ替えます。FACSソートソフトウェアでインデックスソートを有効にして、単一のセルごとにCD45RA、CD49F、CD90の免疫フェノミクスプロファイルを保存します。
PCR増幅における直線性制御のために、それぞれ10個と20個の細胞を持つ2つのウェルをソートします。通常はウェルスH1とH2が使用されます。テンプレートコントロールなしのセルなしで2つの井戸を保ちます, 通常、ウェルH3とH4.プレートを透明な粘着フィルムで密封し、1分間300倍の重力でプレートを回転させます。
スナップはドライアイスの上にプレートを凍結します。その後、マイナス80度で保存します。逆転写および特異的な標的増幅ミックスを2回の反応ミックスの632.5マイクロリットル、101.2マイクロリットルTaq/上付きIII、151.8マイクロリットルプライマーミックス、およびコントロールRNAにスパイク0.7マイクロリットルを加えることによって、
溶液をボルテックスし、チューブの底に液体を収集するためにそれを回転させます。サンプルに加える準備ができるまで氷の上にミックスを保管してください。次に、氷の上のライセートプレートを解凍します。
線形性とテンプレートコントロールを含む92のウェルに、以前に準備された逆転写と特異的なターゲット増幅ミックスの8.75マイクロリットルを追加します。残りの4つのウェルに逆転写制御ミックスなしの8.75マイクロリットルを加えます。その後、プレートを透明な粘着フィルムで密封し、プレートを回転して底部に液体を集める。
プリアンププログラムに従ってプレートをPCR機で実行することにより、逆転写および特異的標的増幅を行います。96ウェルプレートの各ウェルに3マイクロリットルのアッセイローディング試薬をピペット処理して、アッセイローディングプレートを準備します。アッセイローディングプレートの個々のウェルに各プライマーの3マイクロリットルを加えます。
粘着フィルムでプレートを密封し、それを回転させます。プレートを回転させた後、8マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を96ウェルプレートのすべてのウェルにピペットして希釈プレートを準備します。希釈板に2マイクロリットルの増幅サンプルを加えます。
粘着フィルムでプレートを密封します。プレートを10秒間渦盛りして混ぜます。その後、プレートを回転させます。
次に、352マイクロリットルのマスターミックスを35.2マイクロリットルのサンプルローディング試薬と慎重に混合してサンプルローディングミックスを調製します。96ウェルプレートの各ウェルに3.3マイクロリットルのローディングミックスをアリクォートしてサンプルローディングプレートを準備します。希釈したサンプルから2.7マイクロリットルをサンプルローディングプレートの各ウェルに加えます。
粘着フィルムでプレートを密封し、それを回転させます。96マイクロ流体チップで新しい96を取り出します。入り江をキャップを付けて注射器で突き刺して、移動できることを確認します。
チップを45度に傾け、バルブを押し下げながら、各バルブにシリンジのフルボリュームを追加します。IFC コントローラを使用してチップを使用します。各アッセイ入口に、アッセイローディングプレートの各ウェルから4.25マイクロリットルを入れ、気泡を避けます。
気泡がウェルに現れた場合は、ピペットチップでそれらを取り除きます。サンプルローディングプレートの各ウェルから4.25マイクロリットルの各サンプル入口をロードし続け、気泡を避け、気泡がピペットチップでそれらを取り除いているように見える場合。内蔵流体回路コントローラまたはIFCコントローラでチップをロードします。
チップが均等に見え、すべてのチャンバーがロードされていることを確認します。チップの表面にテープで触れてほこりを取り除きます。最後に、マルチプレックスマイクロ流体遺伝子発現プラットフォームでチップを実行します。
成功した実行のヒート マップは、7 ~ 25 個の CT の強い信号を持つサンプルに均等に広がる表現を表示します。コントロールRNAのスパイクのこの増幅曲線は、すべてのウェルが、全ての細胞に対して事前増幅およびqPCR反応が成功したことを検証し、変化がほとんどない10CT程度の明確な発現を有することを確認する。分析分析を用いて細胞群間の類似性を可視化する主成分分析またはPCAは、分子的に異なる細胞のクラスターをここで4つのサブグループを同定するのに役立つ可能性がある。
異なる分子クラスターから細胞の免疫フェノタイプを識別するには、インデックスFCSファイルをFlowJoにロードします。スクリプトエディタを開き、インデックススクリプトを貼り付け、[実行]を押します。各セルは別のゲートに入ります。
各セルをレイアウトエディタに追加し、ファイルsample_complete_data.xlsで利用可能なSCXVから分子定義のグループに従って色を付けます。FACSプロットは、造血幹細胞マーカーCD90およびCD45RAの細胞表面マーカー発現を示しており、クラスター間を判別し、機能的分析のためにそれらを分離するために使用することができる。この手順に従って、新たに発見された亜集団のRNAシーケンシングやインビトロおよびインビボ実験のような他の技術は、どのような分子メカニズムがこの不均一性を引き起こし、亜集団がどのように機能的に異なるのかのような追加の質問に答えるために行うことができる。
この戦略は、研究者が正常および悪性造形の不均一性を調査するだけでなく、発見された亜集団を前向きに分離してさらに研究する道を開いた。
