이 방법은 줄기 세포 이질성이 어떻게 보이는지 및 민감한 암세포에 있는 치료가 어떻게 고립될 수 있는지와 같은 줄기 세포 및 암 필드에 있는 중요한 질문에 대답할 수 있습니다. 이 연구의 주요 장점은 표적 하위 인구의 추가 하류 특성화를 위해 암시노시스와 함께 기술적으로 견고한 단세포 유전자 발현 분석을 결합한다는 것입니다. 이 방법은 암과 줄기 세포 이질성을 조사하기 위하여 이용될 수 있더라도, 또한 유전자 프라이밍 및 혈통 잠재력에 통찰력을 줄 수 있습니다.
프로토콜을 시작하려면 RNA / DNA가없는 벤치에서 390 마이크로 리터 뉴클레아제 프리 워터, 10 %NP-40, 2.8 마이크로 리터 10 밀리미터 dNTP, 10 마이크로 리터 0.1 μg DTT 및 5.3 개의 미세 리터를 혼합하여 96 개의 우물에 대한 충분한 용해 버퍼를 준비하십시오. 소용돌이와 튜브 아래로 회전. 다음으로, 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 용해 버퍼 4개를 배포하고 접착제 필름으로 플레이트를 밀봉합니다.
플레이트아래로 회전하여 하단의 액체를 수집합니다. 셀이 최대 24시간 동안 정렬될 때까지 접시를 얼음 위에 보관하십시오. FACS 기계가 제대로 설정되면, 얼룩 버퍼의 100 마이크로 리터와 새로운 미세 원심 분리기 튜브로 적어도 100 대상 세포를 정렬하여 대상 인구의 재분석을 수행합니다.
FACS는 정렬된 샘플을 기록하여 정렬된 셀을 분석하고 정렬 게이트에서 작동하는지 확인합니다. 그런 다음 96웰 플레이트에서 잘 A1의 드롭을 중심으로 단일 셀 플레이트 정렬을 설정합니다. 중앙에 있는 경우, 빈 96웰 플레이트 의 가장자리 주변의 모든 우물에 50~106마이크로미터 입자를 정렬하여 모든 우물이 각 우물의 중앙에 세포를 얻을 수 있도록 합니다.
플레이트에서 접착제 필름을 제거합니다. Lin-CD34 플러스 CD38 마이너스 셀의 단일 셀을 96 개의 우물 중 92개로 정렬합니다. FACS 선별 소프트웨어에서 인덱스 정렬을 활성화하여 각 단일 셀에 대해 CD45RA, CD49F 및 CD90의 면역페노티픽 프로파일을 저장합니다.
PCR 증폭에서 선형 도급 제어를 위해 각각 10 및 20 셀로 두 개의 우물을 정렬합니다. 웰스 H1과 H2는 일반적으로 사용됩니다. 템플릿 컨트롤없이 두 개의 우물을 유지, 일반적으로 우물 H3와 H4. 선명한 접착제 필름으로 플레이트를 밀봉하고 플레이트를 300배 의 중력으로 1분 동안 회전시합니다.
스냅은 마른 얼음에 접시를 동결. 그런 다음 영하 80도에서 보관하십시오. 대조RNA에서 스파이크된 2회 반응 믹스 632.5 마이크로리터, 101.2 마이크로리터 Taq/SuperscriptIII, 151.8 마이크로리터 프라이머 믹스, 0.7 마이크로리터를 첨가하여 역전사 및 특정 표적 증폭 믹스를 만듭니다.
용액을 소용돌이치고 아래로 회전하여 튜브 바닥에 있는 액체를 수집합니다. 샘플에 추가 될 준비가 될 때까지 얼음에 믹스를 유지합니다. 다음으로, 얼음에 용해 판을 해동.
이전에 준비된 역전사 및 특정 표적 증폭 믹스의 8.75 마이크로리터를 선형성 및 템플릿 컨트롤 없음을 포함하여 92개의 우물에 추가합니다. 나머지 4개의 우물에 역전사 제어 믹스가 없는 8.75 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 명확한 접착제 필름으로 플레이트를 밀봉하고 바닥에 액체를 수집하기 위해 판을 회전.
프리앰프 프로그램에 따라 PCR 기계에서 플레이트를 실행하여 역전사 및 특정 표적 증폭을 수행합니다. 분석 적재 판을 96웰 플레이트의 각 웰에 분석 적재 시약 3마이크로리터를 배관하여 준비합니다. 각 프라이머의 마이크로리터 3개를 분석 적재 플레이트의 개별 우물에 추가합니다.
접착제 필름으로 접시를 밀봉하고 아래로 회전. 플레이트를 회전한 후, 뉴클레아제 자유물의 8마이크로리터를 96웰 플레이트의 모든 우물로 배관하여 희석판을 준비한다. 희석 플레이트에 증폭된 시료 2개를 추가합니다.
접착제 필름으로 접시를 밀봉합니다. 접시를 10초 동안 소용돌이로 섞는다. 그런 다음 접시를 아래로 회전합니다.
다음으로, 35.2 마이크로리터의 마스터 믹스를 35.2 마이크로리터의 시료 로딩 시약과 신중하게 혼합하여 시료 적재 믹스를 준비한다. 96웰 플레이트의 각 웰에 3.3 마이크로리터의 적재 믹스를 알리싱하여 시료 적재 플레이트를 준비한다. 희석된 샘플에서 2.7 마이크로리터를 샘플 로딩 플레이트의 각 웰에 넣습니다.
접착제 필름으로 접시를 밀봉하고 아래로 회전. 96 마이크로 유체 칩에 의해 새로운 96을 꺼내. 캡이 달린 주사기로 입구를 찔러 서 서 움직일 수 있는지 확인합니다.
칩을 45도로 기울이고 밸브를 누르는 동안 각 밸브에 주사기의 전체 볼륨을 추가합니다. IFC 컨트롤러로 칩을 프라임합니다. 각 분석 입구에 4.25 마이크로리터를 적재하여 각 우물에서 분석 적재 플레이트에 적재하고 거품을 피하십시오.
거품이 우물에 나타나면 파이펫 팁으로 제거합니다. 시료 적재 판의 각 우물에서 4.25 마이크로리터로 각 샘플 입구를 계속 적재하고 거품을 피하고 피펫 팁으로 거품이 제거되는 것처럼 보입니다. 통합 유체 회로 컨트롤러 또는 IFC 컨트롤러로 칩을 로드합니다.
칩이 균일하게 보이고 모든 챔버가 로드되었는지 확인합니다. 테이프로 터치하여 칩 표면에서 먼지를 제거합니다. 마지막으로, 멀티플렉스 미세 유체 유전자 발현 플랫폼에서 칩을 실행한다.
성공적인 실행의 열 맵은 약 7~25개의 CD의 강력한 신호로 샘플 전체의 균일하게 확산된 식을 표시합니다. 제어 RNA에서 스파이크의 이 증폭 곡선은 모든 우물이 거의 또는 전혀 변이없이 약 10 CT의 명확한 발현을 가지고 있음을 확인, 사전 증폭 및 qPCR 반응이 모든 세포에 성공했다는 것을 검증. 치수 감소를 사용하여 세포 그룹 간의 유사성을 시각화하는 원리 성분 분석 또는 PCA는 4개의 하위 그룹을 식별하는 여기에서 분자적으로 구별되는 세포의 클러스터를 구별하는 데 유용할 수 있다.
다른 분자 클러스터에서 세포의 면역 페노형을 식별하려면 인덱스 FCS 파일을 FlowJo에 로드합니다. 스크립트 편집기를 열고 인덱스 스크립트를 붙여 넣은 다음 실행을 누릅니다. 각 셀은 이제 별도의 게이트에 있게 됩니다.
각 셀을 레이아웃 편집기에 추가하고 파일 sample_complete_data.xls 사용할 수 있는 SCXV의 분자 정의 그룹에 따라 색상을 지정합니다. FACS 플롯은 군집을 구별하고 기능 분석을 위해 이를 격리하는 데 사용할 수 있는 조혈 줄기 세포 마커 CD90 및 CD45RA에 대한 세포 표면 마커 발현을 보여준다. 이 절차에 따라, 새로 발견 된 하위 집단의 RNA 시퀀싱 또는 시험관 내 및 생체 내 실험과 같은 다른 기술은 분자 메커니즘이 이 이질성을 일으키는 원인이 되는 것과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수 있으며 하위 집단은 기능적으로 어떻게 다른지.
이 전략은 연구원이 정상 및 악성 조혈증에서 이질성을 조사할 뿐만 아니라 발견 된 하위 집단을 장래 분리하여 추가 연구를 하는 데 사용할 수있는 길을 열었습니다.
