Este método pode responder a perguntas-chave nos campos de células-tronco e câncer, como como a heterogeneidade de células-tronco e como a terapia em células sensíveis do câncer podem ser isoladas. A principal vantagem deste estudo é que combina análise de expressão genética de células únicas tecnicamente robustas, juntamente com a vaccinose para uma caracterização mais a jusante das subpopulações-alvo. Embora este método possa ser usado para investigar o câncer e a heterogeneidade das células-tronco, ele também pode dar insights sobre o potencial de priming e linhagem de genes.
Para começar o protocolo, em um banco livre de RNA/DNA, preparar tampão de lise suficiente para 96 poços com 10% extra misturando 390 microliters nuclease água livre, 17 microliters de 10%NP-40, 2,8 microliters 10 mililitros dNTP, 10 microliters 0.1 molar DTT e 5,3 microliters RNAse inibidor. Vórtice e gire pelo tubo. Em seguida, distribua quatro microliters de tampão de lise para cada poço de uma placa PCR de 96 poços e sele as placas com película adesiva.
Gire as placas para coletar o líquido na parte inferior. Mantenha as placas no gelo até a triagem celular por um máximo de 24 horas. Uma vez que a máquina FACS tenha sido configurada corretamente, realize a reanálise da população-alvo, classificando pelo menos 100 células-alvo em um novo tubo de microcentrifus de microcentragem com 100 microlitres de tampão de manchas.
Os FACS analisam as células classificadas registrando a amostra classificada e certificando-se de que elas acabem no portão de classificação. Em seguida, configure a classificação de placa de célula única, centralizando a queda em bem A1 na placa de 96 poços. Quando estiver centrado, classifique partículas de 50 a 106 micrômetros em todos os poços ao redor da borda de uma placa vazia de 96 poços para garantir que todos os poços obterão uma célula no centro de cada poço.
Remova o filme adesivo das placas. Classifique uma única célula de Lin-CD34 mais células CD38 menos em 92 dos 96 poços. Ative a classificação de índice no software de classificação FACS para salvar o perfil imunofenópico para CD45RA, CD49F e CD90 para cada célula.
Classifique dois poços com 10 e 20 células, respectivamente, para controles de linearidade na amplificação pcr. Poços H1 e H2 são geralmente usados. Mantenha dois poços sem células como nenhum controle de modelo, geralmente poços H3 e H4. Sele as placas com filme adesivo claro e gire as placas a 300 vezes a gravidade por um minuto.
Es clique para congelar as placas em gelo seco. Em seguida, armazená-los a menos 80 graus Celsius. Faça transcrição reversa e mix de amplificação de alvo específico adicionando 632,5 microliters de mistura de reação de duas vezes, 101,2 microliters Taq/SuperscriptIII, 151,8 microliters primer mix e 0,7 microliters cravados no RNA de controle.
Vórtice a solução e gire-a para baixo para coletar o líquido na parte inferior do tubo. Mantenha a mistura no gelo até que esteja pronta para ser adicionada à amostra. Em seguida, descongele as placas de lise no gelo.
Adicione 8,75 microliters da transcrição reversa previamente preparada e mix de amplificação de alvo específico a 92 poços, incluindo a linearidade e nenhum controle de modelo. Adicione 8,75 microliters sem mistura de controle de transcrição reversa aos quatro poços restantes. Em seguida, sele as placas com filme adesivo claro e gire as placas para coletar líquido na parte inferior.
Realize a transcrição reversa e a amplificação específica do alvo executando a placa em uma máquina PCR de acordo com o programa pré-amplificador. Prepare a placa de carregamento de ensaios, tubondo três microliters de reagente de carga de ensaio para cada poço de uma placa de 96 poços. Adicione três microliters de cada primer a poços individuais na placa de carregamento do ensaio.
Sele a placa com o filme adesivo e gire-a para baixo. Depois de girar a placa, prepare a placa de diluição, canalizando oito microlitadores de água livre nuclease em todos os poços de uma placa de 96 poços. Adicione dois microliters de amostra amplificada à placa de diluição.
Sele a placa com filme adesivo. Misture vórtice a placa por 10 segundos. Em seguida, gire para baixo a placa.
Em seguida, prepare a mistura de carregamento de amostras misturando cuidadosamente 352 microliters de mistura mestre com 35,2 microliters de reagente de carregamento de amostra. Prepare a placa de carregamento da amostra aliquoting 3,3 microliters de mistura de carga para cada poço de uma placa de 96 poços. Adicione 2,7 microliters da amostra diluída em cada poço da placa de carregamento da amostra.
Sele a placa com o filme adesivo e gire-a para baixo. Tire um novo 96 por 96 chip microfluido. Prepare as entradas cutucando-as com uma seringa com um boné para garantir que elas possam ser movidas.
Adicione o volume total das seringas a cada válvula enquanto inclina o chip para 45 graus e pressione a válvula. Prime o chip com o controlador IFC. Carregue cada entrada de ensaio com 4,25 microliters de cada um dos poços na placa de carregamento do ensaio e evite bolhas.
Se aparecerem bolhas no poço, remova-as com uma ponta de pipeta. Continue carregando cada entrada de amostra com 4,25 microliters de cada um dos poços na placa de carregamento da amostra, evitando bolhas, e se aparecerem bolhas removendo-as com uma ponta de pipeta. Carregue o chip com o controlador circuito fluido integrado ou controlador IFC.
Verifique se o chip parece uniforme e que todas as câmaras foram carregadas. Remova o pó da superfície do chip tocando-o com fita adesiva. Finalmente, execute o chip na plataforma de expressão genética microfluida multiplex.
Um mapa de calor de uma corrida bem sucedida exibe a expressão uniformemente espalhada entre as amostras com um forte sinal de cerca de sete a 25 CTs. Esta curva de amplificação de RNA de controle verifica que todos os poços têm expressão clara de cerca de 10 tomografias com pouca ou nenhuma variação, validando que as reações de pré-amplificação e qPCR foram bem sucedidas para todas as células. Análise de Componentes Princípios ou PCA que visualiza as semelhanças entre grupos celulares usando a redução de dimensões pode ser útil para distinguir aglomerados de células molecularmente distintas entre si aqui identificando quatro subgrupos.
Para identificar o imunofenótipo das células de diferentes aglomerados moleculares, carregue o arquivo FCS de índice em FlowJo. Abra o editor de script e cole o script do índice, pressione Run. Cada célula estará agora em um portão separado.
Adicione cada célula ao editor de layout e colora-as de acordo com o agrupamento definido molecularmente do SCXV disponível no arquivo sample_complete_data.xls. As tramas FACS mostram a expressão do marcador de superfície celular para os marcadores hematopoiéticos de células-tronco CD90 e CD45RA que podem ser usados para discriminar entre os clusters e isolá-los para análise funcional. Após este procedimento, outra técnica como o sequenciamento do RNA de subpopulações recém-descobertas ou experimentos in vitro e in vivo pode ser realizada para responder a perguntas adicionais como qual mecanismo molecular causa essa heterogeneidade e como a subpopulação difere funcionalmente.
Essa estratégia abriu caminho para os pesquisadores não apenas investigarem a heterogeneidade em hematopoiese normal e maligna, mas também podem ser usados para isolar prospectivamente as subpopulações descobertas para estudá-las melhor.
