Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области стволовых клеток и рака, такие как то, что неоднородность стволовых клеток выглядит и как терапия в чувствительных раковых клеток могут быть изолированы. Основным преимуществом этого исследования является то, что он сочетает в себе технически надежный одноклеточный анализ экспрессии генов вместе с вакцинозом для дальнейшей характеристики целевых субпопуляций ниже по течению. Хотя этот метод может быть использован для исследования рака и неоднородности стволовых клеток, он также может дать представление о генном грунтовке и потенциале линии.
Чтобы начать протокол, на скамейке без РНК/ДНК, подготовить достаточно лиза буфер для 96 скважин с 10%extra путем смешивания 390 микролитров нуклеазы свободной воды, 17 микролитров 10%NP-40, 2,8 микролитров 10 миллимолярной dNTP, 10 микролитров 0,1 молар DTT, и 5,3 микролитров ингибитора РНК. Вихрь и спина вниз по трубке. Далее разпределим четыре микролитера буфера лиза в каждый колодец 96-колодец ПЦР пластины и запечатать пластины клейкой пленкой.
Спин вниз пластины для сбора жидкости в нижней части. Держите пластины на льду до сортировки клеток в течение максимум 24 часов. После того, как машина FACS была правильно настроена, выполните повторное исследование целевой популяции, сортирует по крайней мере 100 целевых ячеек в новую микроцентрифугную трубку со 100 микролитровами буфера пятен.
FACS анализирует отсортированные ячейки, записывая отсортированную пробу и убедитесь, что они находятся в воротах сортировки. Затем на настройку одноклеточной сортировки пластин, центрирование падение в хорошо A1 в 96-хорошо пластины. Когда он по центру, сортировать от 50 до 106 микрометров частиц во всех скважинах вокруг края пустой пластины 96 скважин, чтобы гарантировать, что все скважины получат ячейку в центре каждой скважины.
Снимите клейую пленку с пластин. Сортировать одну ячейку Lin-CD34 плюс CD38 минус клетки в 92 из 96 скважин. Активируйте сортировку индекса в программном обеспечении для сортировки FACS, чтобы сохранить иммунофенотипический профиль для CD45RA, CD49F и CD90 для каждой ячейки.
Сортировать две скважины с 10 и 20 ячейками соответственно для линейного управления в усилении ПЦР. Обычно используются скважины H1 и H2. Держите две скважины без каких-либо ячеек, как нет шаблона управления, как правило, скважины H3 и H4. Печать пластин с ясной клейкой пленкой и спина пластин в 300 раз тяжести в течение одной минуты.
Привязать заморозить пластины на сухом льду. Затем храните их при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Сделайте обратную транскрипцию и конкретную целевую смесь усиления, добавив 632,5 микролитера двух времен смеси реакции, 101,2 микролитров Taq/SuperscriptIII, 151,8 микролитров грунтовки смеси и 0,7 микролитров шипами в контрольной РНК.
Вихрь раствора и спина его вниз, чтобы собрать жидкость в нижней части трубки. Держите смесь на льду, пока она не будет готова к добавлению в образец. Далее оттаивать лизные плиты на льду.
Добавьте 8,75 микролитров ранее подготовленной обратной транскрипции и конкретную целевую смесь усиления в 92 скважины, включая линейность и отсутствие элементов управления шаблонами. Добавьте 8,75 микролитров без обратной смеси транскрипции в четыре оставшиеся скважины. Затем запечатать пластины с ясной клейкой пленкой и спина пластин для сбора жидкости в нижней части.
Выполните обратную транскрипцию и конкретное целевое усиление, запуская пластину в машине PCR в соответствии с программой предусиливания. Подготовь анализ погрузочной пластины, засовывав три микролитера анализа, загружая реагент к каждой пластине из 96-х колодец. Добавьте три микролитров каждой грунтовки к отдельным скважинам в погрузочной пластине анализа.
Печать пластины с клейкой пленкой и спина его вниз. После вращения пластины, подготовить разбавленной пластины путем трубопроводов восемь микролитров нуклеазы свободной воды во все колодцы 96-хорошо пластины. Добавьте два микролитров усиленного образца к пластине разбавления.
Печать пластины с клейкой пленкой. Смешайте путем вихревого пластины в течение 10 секунд. Затем вращайся вниз по тарелке.
Далее подготовьте смесь погрузочной смеси образца, тщательно смешивая 352 микролитров мастер-микса с 35,2 микролитров образца погрузочного реагента. Подготовь образец погрузочной пластины путем алицитирования 3,3 микролитров погрузочной смеси к каждой пластине из 96-колодец. Добавьте 2,7 микролитров из разбавленного образца в каждую колодец погрузочной пластины образца.
Печать пластины с клейкой пленкой и спина его вниз. Вынюхив новый чип 96 на 96 микрофлюидных чипов. Подготовьте входы, тыкая их шприцем с крышкой, чтобы убедиться, что они могут быть перемещены.
Добавьте полный объем шприцев к каждому клапану, наклоняя чип до 45 градусов и прижимая к клапану. Премьер чип с контроллером IFC. Загрузите каждый вход анализа с 4,25 микролитров из каждой из скважин в анализе погрузочной пластины и избежать пузырьков.
Если пузырьки появляются в колодец, удалите их кончиком пипетки. Продолжить загрузку каждого образца вход с 4,25 микролитров из каждой из скважин в образце загрузки пластины, избегая пузырьков, и если пузырьки появляются удаления их с наконечником пипетки. Загрузите чип контроллером Integrated Fluidics Circuit или контроллером IFC.
Убедитесь, что чип выглядит даже и что все камеры были загружены. Удалите пыль с поверхности чипа, прикоснувшись к ней лентой. Наконец, запустите чип в мультиплексной платформе экспрессии микрофлюидных генов.
Тепловая карта успешного запуска отображает равномерно распределенное выражение между образцами с сильным сигналом от семи до 25 CTs. Эта кривая усиления шипами в управлении РНК проверяет, что все скважины имеют четкое выражение около 10 КТ практически без изменений, подтверждая, что предварительное усиление и qPCR реакции были успешными для всех клеток. Принцип компонентного анализа или PCA, который визуализирует сходство между группами клеток с помощью уменьшения размера, может быть полезен для различения кластеров молекулярно отличающихся клеток друг от друга здесь, идентифицяющих четыре подгруппы.
Чтобы определить иммунофенотип клеток из различных молекулярных кластеров, загрузите файл индекса FCS в FlowJo. Откройте редактор сценария и вставьте сценарий индекса, нажмите Run. Теперь каждая ячейка будет в отдельных воротах.
Добавьте каждую ячейку в редактор макета и раскрась их в соответствии с молекулярно-определенной группировкой из SCXV, доступной в файле sample_complete_data.xls. Участки FACS показывают выражение маркера поверхности клетки для гематопоэтических маркеров стволовых клеток CD90 и CD45RA, которые могут быть использованы для различеизации кластеров и их изоляции для функционального анализа. После этой процедуры, другой метод, как РНК секвенирования вновь обнаруженных субпопуляций или in vitro и in vivo эксперименты могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительный вопрос, как то, что молекулярный механизм вызывает эту неоднородность и как субпопуляция отличается функционально.
Эта стратегия проложила путь для исследователей, чтобы не только исследовать неоднородность в нормальных и злокачественных гематопоэз, но также может быть использован для потенциально изолировать обнаруженных субпопуляций для дальнейшего их изучения.
