يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأعصاب المعوي وعلم وظائف الأعضاء المعدية المعوية ، مثل ، ما هي آليات استثارة الخلايا enterochromaffin والاستجابة للمحفزات اللمعانية ، وما هي آليات الإفراج عن هرمون الجهاز الهضمي؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح لنا لدراسة بالتفصيل enterochromaffin الخلايا باستخدام تقنيات خلية واحدة، مثل الفيزيولوجيا الكهربائية. وسوف يكون إثبات الإجراء المؤلفين الأولين كيتلين كنوتسون وبيتر ستريج، التكنولوجيين المتميزين الذين طوروا هذه التقنيات.
لبدء هذا الإجراء، ضع إبرة حقنة من ستة ملليلتر مليئة بـ PBS البارد في تجويف الجزء المعوي المستخرج. استخدام ملقط microdissection، المشبك وختم الأمعاء حول إبرة الحقنة، وبس بلطف ستة ملليلتر من برنامج تلفزيوني من خلال التجويف لشطف بعيدا أي البراز. بعد ذلك ، عكس النسيج المعوي عن طريق نسج بلطف ملقط microdissection من خلال التجويف ، معسر جدار معوي ، والتراجع عن الأنسجة القريبة إلى طرف ملقط.
كرر هذه العملية حتى الجزء من الداخل إلى الخارج مع التجويف التي تواجه الخارج. باستخدام مقص microdissection، وقطع شرائح الأنسجة إلى قطع سنتيمتر واحد. ثم نقل شرائح الأنسجة إلى منقار 50 ملليلتر مليئة بخمسة ملليلترات من PBS العقيمة.
في وقت لاحق ، مفروم قطع الأنسجة إلى اتساق السيل. نقل الأنسجة المفروم و 15 ملليلتر من الجليد البارد PBS إلى أنبوب نظيف 50 ملليلتر. Triturate مرتين مع ماصة نقل.
انتظر حتى تستقر الأنسجة. بعد ذلك، إزالة 15 ملليلتر من عظمى برنامج تلفزيوني واستبدالها مع برنامج تلفزيوني جديد. كرر هذه العملية ثلاث مرات، حتى برنامج تلفزيوني واضح.
لأول عملية هضم، من حمام الماء، استرداد واحدة من أنابيب 50 ملليلتر تحتوي على 10 ملليلتر من وسائل الإعلام الهضم قبل الدافئة. بعد ذلك، إضافة 250 ميكرولتررس من محلول الكولاجين برنامج تلفزيوني في الأنبوب مع القطع المعوية المفروم. وأخيرا، تم إضافة قطع الأنسجة المعوية المفروم إلى وسائل الإعلام الهضم ومحلول الكولاجين برنامج تلفزيوني.
ثم ضع العينة في حمام مائي لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. ببطء الثدي الأنسجة مرة واحدة مع ماصة المصلية 10 ملليلتر والسماح لفترة وجيزة قطعة الأنسجة تسوية. استخدام ماصة نقل لإزالة 10 ملليلتر من عظمى.
لعملية الهضم الثانية، إضافة 250 ميكرولترات من محلول الكولاجين برنامج تلفزيوني إلى الأنسجة ووضعها في حمام مائي في 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، ببطء ثدي الحل مرة واحدة مع ماصات مصلي 10 ملليلتر. ثم إزالة 10 ملليلتر من عظمى.
لعملية الهضم الثالثة، أضف 250 ميكرولترات من محلول الكولاجينة PBS في الأنبوب. ضعه في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم هز الأنبوب مرتين إلى ثلاث مرات في الدقيقة بكثافة أعلى من الهضم واحد واثنين.
في وقت لاحق، ببطء ماصة الأنسجة صعودا وهبوطا مع ماصات المصلية 10 ملليلتر والسماح لقطع الأنسجة لتسوية لفترة قصيرة. نقل 10 ملليلتر من عظمى في أنبوب جديد 15 ملليلتر. إضافة ملليلترين من خلية EC الدافئة وسائل الإعلام ثقافة كاملة وعكس مرة واحدة لخلط.
بعد ذلك، تدور العينة في 100 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد خمس دقائق، وإزالة فائقة وإعادة تعليق بيليه المتبقية في 2.5 ملليلتر من خلية EC الدافئة وسائل الإعلام ثقافة كاملة. لعملية الهضم الرابعة، كرر إجراءات الهضم، ولكن قم بزيادة وقت الحضانة بمقدار 15 دقيقة بالنسبة إلى القولون، وتبقى في 10 دقائق لل jejunum.
لثقافة الخلايا، استخدم ماصة نقل للجمع بين تعليق الخلية التي تم جمعها من الهضم ثلاثة وأربعة في أنبوب جديد 15 ملليلتر. إزالة aliquot 10 ميكرولتر من الخلايا والعد مع قياس الهيموسيت. ثم تدور تعليق الخلية المتبقية في 100 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد خمس دقائق، قم بإزالة المارج وأضف وسائل الإعلام ثقافة الخلية EC كاملة باستخدام ماصات المصلية 5 ملليلتر في كثافة مليون خلية لكل ملليلتر. إعادة تعليق الأنسجة باستخدام ماصة نقل. في وقت لاحق، وإزالة المغلفة الأطباق ثقافة الزجاج القاع من الحاضنة.
باستخدام ماصة P1000، استبدل المصفوفة الخلوية الإضافية من كل طبق ثقافة بـ 250 ميكرولترات من تعليق الخلية النهائي. لتحقيق خلية كاملة gigaseal، خفض القطب الكهربائي في حل الحمام. مع micromanipulator، مناورة القطب الطرف في الطائرة مع والأفقية مباشرة من الخلية.
ثم طرد 0.2 ملليلتر من الهواء من الحقنة. قم بتحريك القطب أفقياً على طول محور X لمس الخلية. راقب الغمازة لتظهر على خلية EC، وزيادة في مقاومة الغشاء في اختبارات الختم.
تطبيق 0.1 إلى 0.2 ملليلتر من الشفط على الحقنة وعقد المكبس ثابت حتى يتحقق 100 ميجا أوم. ثم الافراج عن قبضة من المكبس. انتظر الخلية إلى gigaseal.
ثم قطع بلطف الحقنة. لتسجيل خلية كاملة الجهد بوابات الصوديوم الحالية، وتطبيق ضغطة سريعة من الشفط على حقنة. كرر حتى يتم تحقيق وصول الخلية بأكملها قبل قطع بلطف الحقنة.
بعد ذلك، قم بتشغيل تعويض السعة الخلية بأكملها وضبط السعة ومقاومة السلسلة. تشغيل تعويض مقاومة السلسلة. مع تأخر تعيين في 60 ميكرو ثانية، وضبط سلسلة تعويض المقاومة وإغلاق اختبار الختم.
تسجيل ما معدله خمسة أشواط من خلية كاملة الجهد بوابة التيار الصوديوم. بسرعة تأخذ علما اثنين من معلمات التيار الصوديوم الجهد مسور: الجهد في نافذة الحالية، والكثافة التيار الصوديوم الذروة. لتسجيل إمكانات العمل التي تم الحصول عليها، قم بتبديل الوضع من المشبك الكهربائي إلى المشبك الحالي.
تحميل بروتوكول المشبك الحالي العرضي. ضبط عقد الحالي إلى صفر picoamp هنا وتشغيل الأمر الخارجي. سجل إمكانات العمل التي تم الحصول عليها.
لاحظ أقل قدر من حقن الحالية لاطلاق النار قبالة احتمال العمل. لتسجيل إمكانات العمل التلقائي، قم بإيقاف تشغيل الأمر الخارجي. تحميل بروتوكول المشبك الحالي الخالي من الفجوة.
تغيير الحالي القابض إلى كمية الحالية التي تم إدخالها في آخر عملية مسح في البروتوكول الذي تم الحصول عليه الذي لم يطلق احتمال إجراء. بعد ذلك، قم بتشغيل الأمر الخارجي. تحقق من أن عقد الحالية المتوقعة يجلب احتمالية الغشاء تحت عتبة لاطلاق النار على احتمال العمل.
ضبط التيار عقد إذا لزم الأمر وتسجيل النشاط العفوي. الثقافات التي تم تحسينها للفيزياء الكهربائية تتكون من خلايا واحدة وكتل صغيرة مع إشارة CFP مشرق. عندما لم يتم تحسين ظروف الثقافة، تتكون ثقافة الخلايا الظهارية من كتل كبيرة، والحطام الخلوي العائم، والأغشية التالفة، وضعف إشارة CFP في خلايا المفوضية الأوروبية.
تم الحصول على الخلايا الكاملة في EC 30 زائد أو ناقص 7٪ من المحاولات من ثقافات القولون، و 41 زائد أو ناقص 3٪ من المحاولات من ثقافة jejunum. بواسطة الخلايا الكاملة فيزيولوجيا الكهربائية، تم تسجيل تيارات الصوديوم من 81.3 زائد أو ناقص 4.0٪ من الخلايا الإيجابية TPH-1 CPF من jejunum و 64.1 زائد أو ناقص 9.2٪ منهم من القولون. من 59 خلايا EC من الثقافات jejunum، أطلقت 19 خلية EC في وضع المشبك الحالي AP عفوية، أطلقت 29 خلايا EC AP فقط عندما تم الحصول عليها بواسطة بروتوكول خطوة في وضع المشبك الحالي، و11 خلايا EC لم تطلق AP تلقائيًا أو عن طريق البروتوكول التدريجي.
أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن بروتوكول الهضم الأمثل للثقافات الظهارية الأولية قد يكون متغيرًا بين الاستخدامات، لذلك من المهم تحديد المقدار الأمثل من الانفعالات للحصول على خلايا مفردة. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل PCR الخلية المفردة وفلوريسنس، للإجابة على أسئلة إضافية، مثل ما تعبر عنه الخلايا المعوية وكيف تقترن المحفزات بالإشارة بين الخلايا. بعد هذا التطور، مهدت هذه التقنية الطريق للأبحاث في فسيولوجيا الجهاز الهضمي لاستكشاف كيفية عمل الخلايا المعوية وكيف تنظم الحركة المعدية المعوية وإفراز في الفئران.
