Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na neurociência entônica e fisiologia gastrointestinal, tais como, quais são os mecanismos de excitabilidade celular enterochromaffin e resposta a estímulos luminosos, e quais são os mecanismos de liberação hormonal gastrointestinal? A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite estudar em detalhes células enteroromaffin usando técnicas unicelulares, como eletrofisiologia. Demonstrando o procedimento serão os co-primeiros autores Kaitlyn Knutson e Peter Strege, os excelentes tecnólogos que desenvolveram essas técnicas.
Para iniciar este procedimento, coloque uma agulha de seringa de seis mililitros cheia de PBS gelado no lúmen do segmento intestinal extraído. Use os fórceps de microdisseção, aperte e sele os intestinos ao redor da agulha de seringa, e levemente lave seis mililitros de PBS através do lúmen para enxaguar qualquer matéria fecal. Em seguida, inverta o tecido intestinal tecendo suavemente os fórceps de microdisseção através do lúmen, beliscando uma parede intestinal e retraindo o tecido proximal à ponta dos fórceps.
Repita este processo até que o segmento esteja de dentro para fora com o lúmen voltado para fora. Usando uma tesoura de microdisseção, corte os segmentos teciduais em pedaços de um centímetro. Em seguida, transfira os segmentos de tecido para um béquer de 50 mililitros cheios de cinco mililitros de PBS estéreis.
Posteriormente, pique as peças teciduais a uma consistência liquefeito. Transfira o tecido picado e 15 mililitros de PBS gelado para um tubo limpo de 50 mililitros. Triturar duas vezes com a pipeta de transferência.
Espere o tecido se acalmar. Depois, remova 15 mililitros do supernatante PBS e substitua por PBS fresco. Repita este processo três vezes, até que o PBS esteja limpo.
Para a primeira digestão, a partir do banho de água, recupere um dos tubos de 50 mililitros contendo 10 mililitros de mídia de digestão pré-aquecida. Em seguida, adicione 250 microliters da solução de colagenase PBS no tubo com as peças intestinais picadas. Finalmente, pedaços de tecido intestinal picados foram adicionados à mídia de digestão e à solução de colagenase PBS.
Em seguida, coloque a amostra em um banho de água por cinco minutos a 37 graus Celsius. Titule lentamente o tecido uma vez com uma pipeta sorológica de 10 mililitros e deixe brevemente as peças de tecido se acalmarem. Use uma pipeta de transferência para remover 10 mililitros do supernatante.
Para a segunda digestão, adicione 250 microlitadores da solução de colagenase PBS ao tecido e coloque-o em um banho de água a 37 graus Celsius. Depois, titula a solução uma vez com uma pipeta sorológica de 10 mililitros. Em seguida, remova 10 mililitros do supernante.
Para a terceira digestão, adicione 250 microliters da solução de colagem PBS no tubo. Coloque-o em um banho de água Celsius de 37 graus por 10 minutos. Em seguida, agite o tubo duas a três vezes por minuto em uma intensidade maior do que as digestões um e dois.
Posteriormente, pipeta lentamente o tecido para cima e para baixo com uma pipeta sorológica de 10 mililitros e permite que os pedaços de tecido se acomodem por um curto período de tempo. Transfira 10 mililitros do supernante para um novo tubo de 15 mililitros. Adicione dois mililitros de células EC aquecidas completas mídia de cultura e inverta uma vez para misturar.
Em seguida, gire a amostra a 100 g por cinco minutos em temperatura ambiente. Após cinco minutos, remova o supernasciente e suspenda a pelota restante em 2,5 mililitros de células EC aquecidas, mídia de cultura completa. Para a quarta digestão, repita os procedimentos de digestão, mas aumente o tempo de incubação em 15 minutos para o cólon, e permaneça em 10 minutos para jejunum.
Para cultivar as células, use uma pipeta de transferência para combinar as suspensões celulares coletadas das digestões três e quatro em um novo tubo de 15 mililitros. Remova uma alíquota de 10 microliter de células e conte com um hemócito. Em seguida, gire a suspensão restante da célula a 100 g por cinco minutos em temperatura ambiente.
Após cinco minutos, remova o supernasce e adicione mídia de cultura completa de células CE usando uma pipeta sorológica de 5 mililitros a uma densidade de um milhão de células por mililitro. Suspenda o tecido usando uma pipeta de transferência. Posteriormente, remova os pratos de cultura de fundo de vidro revestidos da incubadora.
Usando uma pipeta P1000, substitua a matriz celular extra de cada prato de cultura por 250 microliters da suspensão celular final. Para alcançar um gigaseal de células inteiras, baixe o eletrodo na solução do banho. Com o micromanipulador, manoenda a ponta do eletrodo no plano com e diretamente horizontal da célula.
Em seguida, expelir 0,2 mililitros de ar da seringa. Mova suavemente o eletrodo horizontalmente ao longo do eixo X para tocar a célula. Observe se uma covinha aparecer na célula CE e um aumento na resistência à membrana nos testes de vedação.
Aplique 0,1 a 0,2 mililitros de sucção na seringa e mantenha o êmbolo estável até que 100 mega-ohms seja alcançado. Em seguida, solte a aderência do êmbolo. Espere a célula para gigaseal.
Em seguida, desconecte suavemente a seringa. Para registrar a corrente de sódio de tensão inteira, aplique uma rápida torneira de sucção em uma seringa. Repita até que todo o acesso à célula seja alcançado antes de desconectar suavemente a seringa.
Em seguida, ligue toda a compensação de capacitância celular e ajuste a capacitância e a resistência à série. Ligue a compensação de resistência da série. Com lag definido em 60 microsegundos, ajuste a compensação de resistência da série e feche o teste de vedação.
Registo uma média de cinco corridas de corrente de sódio de tensão de células inteiras. Observe rapidamente dois parâmetros da corrente de sódio fechada por tensão: A tensão na corrente da janela e o pico da densidade de corrente de sódio. Para registrar os potenciais de ação provocados, troque o modo de grampo de tensão para grampo de corrente.
Carregue o protocolo de grampo de corrente episódica. Ajuste a corrente de retenção para zero picoamp aqui e ligue o comando externo. Regissos os potenciais de ação provocados.
Note a menor quantidade de corrente injetada para disparar um potencial de ação. Para registrar potenciais de ação espontâneas, desligue o comando externo. Carregue um protocolo de grampo de corrente livre de lacunas.
Altere a corrente de retenção para a quantidade de corrente injetada na última varredura no protocolo provocado que não disparou um potencial de ação. Posteriormente, ligue o comando externo. Verifique duas vezes se a corrente de retenção prevista traz o potencial da membrana abaixo do limiar para disparar um potencial de ação.
Ajuste a corrente de retenção, se necessário, e regise a atividade espontânea. Culturas otimizadas para eletrofisiologia consistiam em células únicas e pequenos aglomerados com sinal CFP brilhante. Quando as condições de cultura não foram otimizadas, a cultura das células epiteliais consistia em grandes aglomerados, detritos celulares flutuantes, membranas danificadas e sinal CFP fraco nas células CE.
As células inteiras da CE foram obtidas a 30 mais ou menos 7% das tentativas de culturas de cólon, e 41 mais ou menos 3% das tentativas da cultura jejunum. Por eletrofisiologia celular inteira, as correntes de sódio foram registradas a partir de 81,3 mais ou menos 4,0% das células positivas TPH-1 CPF de jejunum e 64,1 mais ou menos 9,2% delas de cólon. Das 59 células EC das culturas jejunum, 19 células EC no modo de fixação atual dispararam AP espontânea, 29 células EC dispararam AP apenas quando provocadas por um protocolo de passo no modo de fixação atual, e 11 células EC não dispararam AP espontaneamente ou por protocolo de passo.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o protocolo ideal de digestão para culturas epiteliais primárias pode ser variável entre os usos, por isso é importante determinar a quantidade ideal de agitação para obter células únicas. Após este procedimento, outros métodos, como PCR de células únicas e fluorescência, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o que as células enterochromaffin expressam e como os estímulos são acoplados à sinalização intercelular. Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que as pesquisas em fisiologia gastrointestinal explorassem como funcionam as células enteroromafina e como regulam a motilidade e secreção gastrointestinal em camundongos.
