Este método puede ayudar a responder preguntas clave en neurociencia entérica y fisiología gastrointestinal, como, ¿cuáles son los mecanismos de excitabilidad de células enterocromafinas y respuesta a estímulos luminales, y cuáles son los mecanismos de liberación de hormonas gastrointestinales? La principal ventaja de esta técnica es que nos permite estudiar en detalle las células enterocromfinas utilizando técnicas de una sola célula, como la electrofisiología. Demostrando el procedimiento serán coautores Kaitlyn Knutson y Peter Strege, los destacados tecnólogos que desarrollaron estas técnicas.
Para comenzar este procedimiento, coloque una aguja de jeringa de seis mililitros llena de PBS helada en el lumen del segmento intestinal extraído. Utilice los fórceps de microdisección, sujete y selle los intestinos alrededor de la aguja de la jeringa, y enjuague suavemente seis mililitros de PBS a través del lumen para enjuagar cualquier materia fecal. A continuación, invierta el tejido intestinal tejiendo suavemente los fórceps de microdisección a través del lumen, pellizcando una pared intestinal y retrayendo el tejido proximal a la punta de los fórceps.
Repita este proceso hasta que el segmento esté de adentro hacia afuera con el lumen mirando hacia afuera. Usando tijeras de microdisección, corte los segmentos de tejido en trozos de un centímetro. Luego transfiera los segmentos de tejido a un vaso de precipitados de 50 mililitros lleno de cinco mililitros de PBS estéril.
Posteriormente, picar las piezas de tejido a una consistencia licuada. Transfiera el tejido picado y 15 mililitros de PBS helado a un tubo limpio de 50 mililitros. Triturar dos veces con la pipeta de transferencia.
Espere a que el tejido se asiente. Después, retire 15 mililitros del sobrenadante PBS y sustitúyalo con PBS fresco. Repita este proceso tres veces, hasta que el PBS esté claro.
Para la primera digestión, desde el baño de agua, recuperar uno de los tubos de 50 mililitros que contienen 10 mililitros de medios de digestión precalentó. A continuación, añadir 250 microlitros de la solución de colagenasa PBS en el tubo con las piezas intestinales picadas. Finalmente, se añadieron trozos de tejido intestinal picados a los medios de digestión y a la solución de colagenasa PBS.
A continuación, coloque la muestra en un baño de agua durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Valore lentamente el tejido una vez con una pipeta serológica de 10 mililitros y deje que las piezas de tejido se asienten. Utilice una pipeta de transferencia para eliminar 10 mililitros del sobrenadante.
Para la segunda digestión, añadir 250 microlitros de la solución de colagenasa PBS al tejido y colocarlo en un baño de agua a 37 grados centígrados. Después, valore lentamente la solución una vez con una pipeta serológica de 10 mililitros. A continuación, retire 10 mililitros del sobrenadante.
Para la tercera digestión, añadir 250 microlitros de la solución de colagenasa PBS en el tubo. Colóquelo en un baño de agua Celsius de 37 grados durante 10 minutos. A continuación, agitar el tubo de dos a tres veces por minuto a una intensidad más alta que las digestiones uno y dos.
Posteriormente, pipetee lentamente el tejido hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica de 10 mililitros y permita que las piezas de tejido se asienten por un corto tiempo. Transfiera 10 mililitros del sobrenadante a un nuevo tubo de 15 mililitros. Agregue dos mililitros de medios de cultivo completos de células EC calentadas e invierta una vez para mezclar.
A continuación, gire la muestra a 100 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de cinco minutos, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet restante en 2,5 mililitros de medios de cultivo completos de células EC calentadas. Para la cuarta digestión, repita los procedimientos de digestión, pero aumente el tiempo de incubación en 15 minutos para el colon, y permanezca en 10 minutos para el yeyuno.
Para cultivar las células, utilice una pipeta de transferencia para combinar las suspensiones celulares recogidas de las digestiones de tres y cuatro en un nuevo tubo de 15 mililitros. Retire una alícuota de 10 microlitrolidores de células y cuente con un hemocitociómetro. Luego gire la suspensión celular restante a 100 g durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Después de cinco minutos, retire el sobrenadante y agregue medios de cultivo completos de células EC utilizando una pipeta serológica de 5 mililitros a una densidad de un millón de células por mililitro. Vuelva a suspender el tejido con una pipeta de transferencia. Posteriormente, retire los platos de cultivo recubiertos de fondo de vidrio de la incubadora.
Con una pipeta P1000, reemplace la matriz celular adicional de cada plato de cultivo por 250 microlitros de la suspensión celular final. Para lograr un gigaseal de celda entera, baje el electrodo en la solución de baño. Con el micromaniprógrafo, manegre la punta del electrodo en plano con y directamente horizontal desde la célula.
A continuación, expulse 0,2 mililitros de aire de la jeringa. Mueva suavemente el electrodo horizontalmente a lo largo del eje X para tocar la célula. Observe que aparezca un hoyuelo en la célula EC y un aumento de la resistencia a la membrana en las pruebas de sello.
Aplique de 0,1 a 0,2 mililitros de succión en la jeringa y mantenga el émbolo estable hasta que se logren 100 mega-ohmios. A continuación, suelte la empuñadura del émbolo. Espere a que la célula se gigasellar.
A continuación, desconecte suavemente la jeringa. Para registrar la corriente de sodio cerrada por voltaje de toda la celda, aplique un toque rápido de succión en una jeringa. Repita el proceso hasta que se logre el acceso a toda la célula antes de desconectar suavemente la jeringa.
A continuación, active toda la compensación de capacitancia de celda y ajuste la capacitancia y la resistencia de la serie. Active la compensación de resistencia de la serie. Con el retardo fijado en 60 microsegundos, ajuste la compensación de resistencia de la serie y cierre la prueba del sello.
Registre un promedio de cinco corridas de corriente de sodio de compuerta de voltaje de celda entera. Tome nota rápidamente de dos parámetros de la corriente de sodio cerrada por voltaje: La tensión en la corriente de la ventana y la densidad de corriente de sodio pico. Para registrar los potenciales de acción provocados, cambie el modo de la abrazadera de voltaje a la abrazadera de corriente.
Cargue el protocolo de abrazadera de corriente episódica. Ajuste la corriente de retención a cero picoamp aquí y active el comando externo. Registre los potenciales de acción provocados.
Tenga en cuenta la menor cantidad de corriente inyectada para disparar un potencial de acción. Para registrar potenciales de acción espontánea, desactive el comando externo. Cargue un protocolo de abrazadera de corriente sin huecos.
Cambie la corriente de retención a la cantidad de corriente inyectada en el último barrido en el protocolo provocado que no disparó un potencial de acción. Posteriormente, active el comando externo. Compruebe que la corriente de retención pronosticada lleva el potencial de membrana por debajo del umbral para disparar un potencial de acción.
Ajuste la corriente de retención si es necesario y registre la actividad espontánea. Los cultivos que se han optimizado para la electrofisiología consistían en células individuales y pequeños grupos con señal CFP brillante. Cuando no se han optimizado las condiciones de cultivo, el cultivo celular epitelial consistía en grandes grumos, desechos celulares flotantes, membranas dañadas y señal débil de CFP en las células de las CE.
Las células enteras ec se obtuvieron en 30 más o menos 7% de los intentos de cultivos de colon, y 41 más o menos 3% de los intentos de cultivo de jejunum. Por electrofisiología celular entera, las corrientes de sodio se registraron a partir de 81,3 más o menos 4,0% de las células positivas de TPH-1 CPF del y 64,1 más o menos el 9,2% de ellas de colon. De 59 células EC de cultivos de jejunum, 19 células EC en el modo de abrazadera actual dispararon AP espontáneo, 29 células EC dispararon AP sólo cuando fueron provocadas por un protocolo de paso en modo de abrazadera actual, y 11 células EC no se dispararon AP espontáneamente o por protocolo de paso.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el protocolo de digestión óptimo para cultivos epiteliales primarios puede ser variable entre usos, por lo que es importante determinar la cantidad óptima de agitación para obtener células individuales. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la PCR de una sola célula y la fluorescencia, para responder preguntas adicionales, como qué expresan las células enterocromfina y cómo se acoplan los estímulos a la señalización intercelular. Después de este desarrollo, esta técnica allanó el camino para que las investigaciones en fisiología gastrointestinal exploraran cómo funcionan las células enterocromfina y cómo regulan la motilidad gastrointestinal y la secreción en ratones.
