Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés en neurosciences entériques et la physiologie gastro-intestinale, tels que, quels sont les mécanismes de l’excitabilité cellulaire enterochromaffine et la réponse aux stimuli luminaux, et quels sont les mécanismes de libération d’hormones gastro-intestinales? Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet d’étudier en détail les cellules entérochromaffine à l’aide de techniques unicell cellules, comme l’électrophysiologie. Kaitlyn Knutson et Peter Strege, les technologues exceptionnels qui ont mis au point ces techniques, feront la démonstration de la procédure.
Pour commencer cette procédure, placez une aiguille de seringue de six millilitres remplie de PBS glacé dans le lumen du segment intestinal extrait. Utilisez les forceps de microdissection, pincez et scellez les intestins autour de l’aiguille de seringue, et rincez doucement six millilitres de PBS par le lumen pour rincer n’importe quelle matière fécale. Ensuite, inverser le tissu intestinal en tissant doucement les forceps de microdissection à travers le lumen, pincer une paroi intestinale, et de rétracter le tissu proximal à la pointe des forceps.
Répétez ce processus jusqu’à ce que le segment soit à l’intérieur et que le lumen soit orienté vers l’extérieur. À l’aide de ciseaux de microdissection, couper les segments de tissu en morceaux d’un centimètre. Ensuite, transférez les segments de tissu dans un bécher de 50 millilitres rempli de cinq millilitres de PBS stérile.
Par la suite, hacher les morceaux de tissu à une consistance liquéfiée. Transférer le tissu haché et 15 millilitres de PBS glacé dans un tube propre de 50 millilitres. Triturer deux fois avec la pipette de transfert.
Attendez que le tissu se dépose. Par la suite, retirer 15 millilitres du supernatant PBS et les remplacer par du PBS frais. Répétez ce processus trois fois, jusqu’à ce que le PBS soit clair.
Pour la première digestion, dans le bain d’eau, récupérez l’un des tubes de 50 millilitres contenant 10 millilitres de supports de digestion préchauffés. Ensuite, ajoutez 250 microlitres de la solution de collagène PBS dans le tube avec les morceaux intestinaux hachés. Enfin, des morceaux minces de tissu intestinal ont été ajoutés au média de digestion et à la solution de collagène de PBS.
Ensuite, placez l’échantillon dans un bain d’eau pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Titrer lentement le tissu une fois avec une pipette sérologique de 10 millilitres et laisser brièvement les morceaux de tissu s’installer. Utilisez une pipette de transfert pour enlever 10 millilitres du supernatant.
Pour la deuxième digestion, ajouter 250 microlitres de la solution de collagène PBS au tissu et le placer dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Ensuite, titrage lentement la solution une fois avec une pipette sérologique de 10 millilitres. Retirez ensuite 10 millilitres du supernatant.
Pour la troisième digestion, ajouter 250 microlitres de la solution de collagène PBS dans le tube. Placez-le dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, secouez le tube deux à trois fois par minute à une intensité plus élevée que les digestions une et deux.
Par la suite, pipette lentement le tissu de haut en bas avec une pipette sérologique de 10 millilitres et permettre aux morceaux de tissu de se contenter pendant une courte période. Transférer 10 millilitres du supernatant dans un nouveau tube de 15 millilitres. Ajouter deux millilitres de cellules EC réchauffées et inverser une fois pour mélanger.
Ensuite, faites tourner l’échantillon à 100 g pendant cinq minutes à température ambiante. Après cinq minutes, retirer le supernatant et suspendre à nouveau le granulé restant dans 2,5 millilitres de cellules EC réchauffées multimédia de culture complète. Pour la quatrième digestion, répéter les procédures de digestion, mais augmenter le temps d’incubation de 15 minutes pour le côlon, et rester à 10 minutes pour le jejunum.
Pour la culture des cellules, utilisez une pipette de transfert pour combiner les suspensions cellulaires recueillies à partir des digestions trois et quatre dans un nouveau tube de 15 millilitres. Retirer un aliquot de 10 microlitres de cellules et compter à l’aide d’un hémocytomètre. Faites ensuite tourner le reste de la suspension cellulaire à 100 g pendant cinq minutes à température ambiante.
Après cinq minutes, retirez le supernatant et ajoutez un média de culture complet de la cellule EC à l’aide d’une pipette sérologique de 5 millilitres à une densité d’un million de cellules par millilitre. Suspendre à nouveau le tissu à l’aide d’une pipette de transfert. Par la suite, retirer les plats de culture en verre enduit de l’incubateur.
À l’aide d’une pipette P1000, remplacer la matrice cellulaire supplémentaire de chaque plat de culture par 250 microlitres de la suspension cellulaire finale. Pour atteindre un gigaséal cellulaire entier, abaissez l’électrode dans la solution de bain. Avec le micromanipulateur, manœuvrer la pointe de l’électrode en plan avec et directement horizontale de la cellule.
Puis expulser 0,2 millilitres d’air de la seringue. Déplacez doucement l’électrode horizontalement le long de l’axe X pour toucher la cellule. Surveillez l’apparaître d’une fossette sur la cellule EC et une augmentation de la résistance aux membranes lors des essais du joint.
Appliquez 0,1 à 0,2 millilitres d’aspiration sur la seringue et maintenez le piston stable jusqu’à ce que 100 méga-ohms soient atteints. Puis relâchez l’adhérence du piston. Attendez que la cellule se gigaseal.
Puis déconnecter doucement la seringue. Pour enregistrer le courant de sodium à portail de tension de cellules entières, appliquez un robinet rapide d’aspiration sur une seringue. Répétez l’idée jusqu’à ce que l’accès à l’ensemble de la cellule soit atteint avant de déconnecter doucement la seringue.
Ensuite, allumez l’ensemble de la compensation de capacitance cellulaire et ajustez la capacité et la résistance de la série. Allumez la compensation de résistance de série. Avec un décalage fixé à 60 microsecondes, ajustez la compensation de résistance de série et fermez l’essai de joint.
Enregistrez en moyenne cinq séries de courant de sodium à barrière de tension à cellules entières. Prenez rapidement note de deux paramètres du courant de sodium à barrière de tension : la tension au courant de la fenêtre et la densité maximale du courant de sodium. Pour enregistrer les potentiels d’action obtenus, passez du mode de la pince de tension à la pince de courant.
Chargez le protocole épisodique de pince actuelle. Réglez le courant de tenue à zéro picoamp ici et allumez la commande externe. Enregistrez les potentiels d’action obtenus.
Notez le moins de courant injecté pour tirer hors d’un potentiel d’action. Pour enregistrer les potentiels d’action spontanée, éteignez la commande externe. Chargez un protocole de pince à courant sans espace.
Modifier le courant de détention en la quantité de courant injecté dans le dernier balayage dans le protocole obtenu qui n’a pas mis le feu à un potentiel d’action. Par la suite, allumez la commande externe. Vérifiez à nouveau que le courant de détention prévu amène le potentiel de la membrane en dessous du seuil pour tirer un potentiel d’action.
Ajustez le courant de détention si nécessaire et enregistrez l’activité spontanée. Les cultures optimisées pour l’électrophysiologie se composaient de cellules individuelles et de petites touffes avec un signal CFP lumineux. Lorsque les conditions de culture n’ont pas été optimisées, la culture épithéliale des cellules se composait de grosses touffes, de débris cellulaires flottants, de membranes endommagées et d’un faible signal CFP dans les cellules EC.
Des cellules entières d’EC ont été obtenues à 30 plus ou moins 7% des tentatives des cultures du côlon, et 41 plus ou moins 3% des tentatives de culture de jejunum. Par électrophysiologie cellulaire entière, des courants de sodium ont été enregistrés à partir de 81,3 plus ou moins 4,0 % des cellules positives TPH-1 du jejunum et de 64,1 plus ou moins 9,2 % d’entre elles provenant du côlon. Sur 59 cellules EC des cultures jejunum, 19 cellules EC en mode pince actuelle ont tiré ap spontané, 29 cellules EC ont tiré AP seulement lorsqu’elles ont été obtenues par un protocole d’étape en mode pince actuel, et 11 cellules EC n’ont pas tiré AP spontanément ou par protocole étape.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que le protocole optimal de digestion pour les cultures épithéliales primaires peut être variable entre les utilisations, il est donc important de déterminer la quantité optimale d’agitation pour obtenir des cellules individuelles. Après cette procédure, d’autres méthodes, comme la PCR à cellule unique et la fluorescence, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires, comme ce que les cellules entérochromaffine expriment et comment les stimuli sont couplés à la signalisation intercellulaire. Après ce développement, cette technique a ouvert la voie aux recherches en physiologie gastro-intestinale pour explorer comment fonctionnent les cellules entérochromaffine et comment elles régulent la motilité gastro-intestinale et la sécrétion chez la souris.
