この方法は、腸内神経科学や消化管生理学の主要な質問に答える助けになります, 例えば, 腸内のロマフィン細胞の興奮性のメカニズムと発光刺激に応答, そして、消化管ホルモン放出のメカニズムは何ですか?この技術の主な利点は、電気生理学のような単細胞技術を用いて、腸内ロマンフィン細胞を詳細に研究できることです。この手順を実証することは、これらの技術を開発した優れた技術者であるケイトリン・ナットソンとピーター・ストレージの共同執筆者です。
この手順を開始するには、抽出された腸管セグメントの内腔に氷冷PBSで満たされた6ミリリットルの注射針を入れる。マイクロディセクション鉗子を使用し、注射針の周りの腸をクランプして密封し、管腔を通してPBSの6ミリリットルを静かに洗い流して、便体を洗い流します。次に、管腔を通して微小解剖鉗子をそっと織り、腸壁をつまみ、組織を鉗子の先端に近い後退させることによって腸組織を反転させる。
この手順を繰り返して、セグメントが外側を向いている状態でセグメントが裏返しにします。マイクロディセクションはさみを使用して、組織セグメントを1センチメートルに切断します。その後、組織セグメントを5ミリリットルのビーカーに移し、5ミリリットルの無菌PBSを充填した。
続いて、組織片を液化した一貫性にミンチする。みじん切り組織と15ミリリットルの氷冷PBSを清潔な50ミリリットルのチューブに移します。移管ピペットで2回トリチュレートします。
組織が落ち着くのを待ちます。その後、PBS上清を15ミリリットル除去し、新鮮なPBSに交換します。PBSがクリアになるまで、このプロセスを3回繰り返します。
最初の消化のために、水浴から、10ミリリットルの予熱消化培地を含む50ミリリットルのチューブの1つを取り出す。次に、250マイクロリットルのPBSコラゲターゼ溶液を細かく入れた腸片をチューブに加える。最後に、消化培地およびPBSコラゲターゼ溶液にひき肉組織片を添加した。
その後、サンプルを水浴に37°Cで5分間入れます。10ミリリットルの血清ピペットで組織をゆっくりと一度に拍動し、組織片を短時間落ち着かせる。上清の10ミリリットルを除去するために移管ピペットを使用してください。
2回目の消化のために、PBSコラゲレーターーゼ溶液250マイクロリットルを組織に加え、摂氏37度の水浴に入れます。その後、10ミリリットルの血清ピペットで溶液をゆっくりと一度に飽和させる。その後、上清の10ミリリットルを除去します。
3回目の消化のために、チューブにPBSコラゲザーゼ溶液の250マイクロリットルを加えます。37°Cの水浴に10分間入れます。その後、消化器1と2よりも高い強度で毎分2〜3回チューブを振ります。
その後、10ミリリットルの血清ピペットで組織を上下にゆっくりとピペットし、組織片を短時間落ち着かせる。上清の10ミリリットルを新しい15ミリリットルチューブに移します。温めたEC細胞完全培養培地を2ミリリットル加え、一度反転して混合します。
次に、室温で5分間100gで試料を回転させます。5分後、上清を取り除き、残りのペレットを2.5ミリリットルの温めたEC細胞完全培養培地中に再懸濁させた。4回目の消化については、消化手順を繰り返しますが、結腸のインキュベーション時間を15分増やし、全腸の場合は10分にとどまる。
細胞を培養するには、移管ピペットを使用して、消化3および4から採取した細胞懸濁液を新しい15ミリリットルチューブに組み合わせます。細胞の10マイクロリットルのアリコートを取り除き、ヘモサイトメーターで数えます。その後、残りの細胞懸濁液を室温で5分間100gで回転させます。
5分後、上清を取り除き、1ミリリットル当たり100万個の細胞の密度で5ミリリットル血清ピペットを使用してEC細胞完全培養培地を添加する。移管ピペットを使用して組織を再中断します。続いて、コーティングされたガラス底の培養皿をインキュベーターから取り除きます。
P1000ピペットを使用して、各培養皿の余分な細胞マトリックスを最終的な細胞懸濁液の250マイクロリットルに置き換えます。全セルギガシールを達成するには、電極を槽溶液に下げます。マイクロマニピュレータを使用して、セルから直接水平に、平面内の電極先端を操縦します。
その後、注射器から0.2ミリリットルの空気を排出します。セルに触れるには、X軸に沿って電極を水平に動かします。ECセルにディンプルが現れ、シールテストで膜抵抗が増加するのを見てください。
0.1~0.2ミリリットルの吸引をシリンジに塗布し、プランジャーを100メガオームになるまで安定させます。その後、プランジャーからグリップを離します。セルがギガシールするのを待ちます。
その後、注射器をそっと取り外します。全細胞の電圧ゲートナトリウム電流を記録するには、注射器に吸引のクイックタップを適用します。細胞全体のアクセスが達成されるまで繰り返し、注射器を静かに切り離します。
次に、セル全体の容量補償をオンにし、容量とシリーズの抵抗を調整します。シリーズ抵抗補正をオンにします。ラグを60マイクロ秒に設定して、直列抵抗補償を調整し、シールテストを閉じます。
全セル電圧ゲートナトリウム電流の平均5回の実行を記録します。電圧ゲートナトリウム電流の2つのパラメータを素早くメモします:窓電流の電圧とピークナトリウム電流密度。引き出されたアクション電位を記録するには、電圧クランプから電流クランプにモードを切り替えます。
エピソディック電流クランププロトコルをロードします。保持電流をゼロピコインに調整し、外部コマンドをオンにします。引き出されたアクションの可能性を記録します。
アクションの可能性を引き起こすために注入される電流の最小量に注意してください。自発的なアクションの可能性を記録するには、外部コマンドをオフにします。ギャップフリーの電流クランププロトコルをロードします。
保持電流を、アクションの可能性を発生しなかった引き出しプロトコルの最後のスイープで注入された電流の量に変更します。続いて、外部コマンドをオンにします。予測された保持電流が、膜電位を閾値以下に引き下げてアクション電位を発射することを再確認します。
必要に応じて保持電流を調整し、自発的な活動を記録します。電気生理学に最適化された培養物は、単一細胞と明るいCFPシグナルを持つ小さな塊で構成されていました。培養条件が最適化されていない場合、上皮細胞培養は、EC細胞内の大きな塊、浮遊細胞の破片、損傷した膜、および弱いCFPシグナルで構成されていました。
EC全細胞は、結腸培養からの試みの30プラスマイナス7%、およびケイジュナム培養による試みの41プラスマイナス3%で得られた。全細胞の電気生理学では、ナトリウム電流は、EJUNUMからのTPH-1 CPF陽性細胞の81.3プラスマイナス4.0%、結腸から64.1プラスマイナス9.2%から記録された。現在のクランプモードのEC細胞は、現在のクランプモードの59個のEC細胞が自発的APを発射し、29個のEC細胞は現在のクランプモードでステッププロトコルによって引き出された場合にのみAPを発射し、11個のEC細胞はAPを自発的にまたはステッププロトコルによって発射しなかった。
この手順を試みる間、主上皮培養のための最適な消化プロトコルは、使用間で可変である可能性があることを覚えておくことが重要です, 単一細胞を得るために最適な攪拌量を決定することが重要です.この手順に従って、単一細胞PCRや蛍光などの他の方法は、エンテクロマフィン細胞が発現するものや、細胞間シグナル伝達にどのように刺激が結合されるかなどの追加の質問に答えるために実行することができる。この開発後、この技術は、腸内の生理学の研究が、エンテクロマフィン細胞の働きと、マウスの消化管運動と分泌を調節する方法を探求する道を開いた。
