Bu yöntem enterik nörobilim ve gastrointestinal fizyolojide anahtar soruların cevapalmasına yardımcı olabilir, örneğin, enterokromfin hücre uyaranlarının mekanizmaları ve luminal uyaranlara yanıt, ve gastrointestinal hormon salınım mekanizmaları nelerdir? Bu tekniğin en büyük avantajı, elektrofizyoloji gibi tek hücreli teknikler kullanarak enterokromofin hücrelerini ayrıntılı olarak incelememize olanak sağlamasıdır. Prosedürü gösteren ortak ilk yazarlar Kaitlyn Knutson ve Peter Strege, bu teknikleri geliştirilen seçkin teknoloji uzmanları olacaktır.
Bu prosedürü başlatmak için, çıkarılan bağırsak segmentinin lümen içine buz gibi PBS ile doldurulmuş altı mililitrelik şırınga iğneyerleştirin. Mikrodisese forceps kullanın, kenetve şırınga iğne etrafında bağırsak mühür, ve yavaşça herhangi bir dışkı uzak durulama için lümen ile PBS altı mililitre floş. Daha sonra, mikrodisesekuvvetleri lümenden yavaşça geçirerek, bağırsak duvarını çimdikleyerek ve proksimal dokuyu forceps ucuna geri çekerek bağırsak dokusunu ters çevirin.
Bu işlemi, lümen dışa bakacak şekilde içeriden dışa doğru olana kadar tekrarlayın. Mikrodiseksiyon makası kullanarak doku parçalarını bir santimetrelik parçalara ayırın. Sonra doku parçalarını 50 mililitrelik bir kabın içine aktarın.
Daha sonra, sıvılaştırılmış bir tutarlılık için doku parçaları kıyma. Kıyma lı dokuyu ve 15 mililitre buz gibi PBS'yi temiz bir 50 mililitrelik tüpe aktarın. Transfer pipetiyle iki kez triturate.
Dokunun durulmasını bekleyin. Daha sonra, PBS supernatant 15 mililitre çıkarın ve taze PBS ile değiştirin. PBS açık olana kadar bu işlemi üç kez tekrarlayın.
İlk sindirim için, su banyosundan, önceden ısıtılmış sindirim ortamı 10 mililitre içeren 50 mililitrelik tüpler birini almak. Sonra, kıyılmış bağırsak parçaları ile tüp PBS kollajenaz çözeltisi 250 mikrolitre ekleyin. Son olarak, kıyılmış bağırsak dokusu parçaları sindirim ortamı ve PBS kollajenaz çözeltisi eklendi.
Daha sonra, 37 santigrat derece beş dakika boyunca bir su banyosunda örnek yerleştirin. Yavaş yavaş 10 mililitrelik serolojik pipet ile bir kez doku titre ve kısaca doku parçaları yerleşmek sağlar. Supernatant 10 mililitre kaldırmak için bir transfer pipet kullanın.
İkinci sindirim için, dokuya PBS kollajenaz çözeltisi 250 mikrolitre ekleyin ve 37 santigrat derece bir su banyosu yerleştirin. Daha sonra, yavaş yavaş 10 mililitrelik serolojik pipet ile bir kez çözelti titre. Sonra supernatant 10 mililitre çıkarın.
Üçüncü sindirim için, tüp PBS kollajenaz çözeltisi 250 mikrolitre ekleyin. 10 dakika boyunca 37 derece lik bir su banyosuna koyun. Daha sonra bir ve iki sindirim daha yüksek bir yoğunlukta dakikada 2-3 kez tüp sallayın.
Daha sonra, yavaş yavaş pipet doku yukarı ve aşağı 10 mililitrelik serolojik pipet ile ve doku parçaları kısa bir süre için yerleşmek için izin. 10 mililitre lik süpernatantı yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın. Isınmış EC hücre tam kültür medya iki mililitre ekleyin ve karıştırmak için bir kez ters.
Daha sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 100 g'da numuneyi döndürün. Beş dakika sonra, supernatant çıkarın ve ısıtılan EC hücre tam kültür medya 2,5 mililitre kalan pelet yeniden askıya. Dördüncü sindirim için, sindirim prosedürleri tekrarlayın, ancak kolon için 15 dakika kuluçka süresini artırmak, ve jejunum için 10 dakika kalır.
Hücreleri kültüre almak için, üç ve dört sindirimden toplanan hücre süspansiyonlarını yeni bir 15 mililitrelik tüpe dönüştürmek için bir transfer pipetkullanın. Hücrelerin 10 mikrolitrelik aliquot çıkarın ve bir hemositometre ile saymak. Daha sonra kalan hücre süspansiyonuna oda sıcaklığında beş dakika boyunca 100 g'da döndürün.
Beş dakika sonra, supernatant çıkarın ve mililitre başına bir milyon hücre yoğunluğunda 5 mililitrelik serolojik pipet kullanarak EC hücre tam kültür medya ekleyin. Transfer pipeti kullanarak dokuyu yeniden askıya alın. Daha sonra, kaplamalı cam alt kültür yemeklerini kuvözden çıkarın.
Bir P1000 pipet kullanarak, her kültür çanaktan ekstra hücresel matrisi son hücre süspansiyonunun 250 mikrolitresiyle değiştirin. Bütün bir hücre gigaseal elde etmek için, banyo çözeltisi içine elektrot indirin. Mikromanipülatör ile, düzlemdeki elektrot ucunu hücreden doğrudan yatay olarak çevirin.
Sonra şırıngadan 0.2 mililitre hava çıkar. Hücreye dokunmak için elektrotu X ekseni boyunca yatay olarak hafifçe hareket ettirin. EC hücresinde bir gamzenin görünmesini ve fok testlerinde membran direncinin artmasını izleyin.
Şırınganın üzerine 0,1 ila 0,2 mililitre emme uygulayın ve 100 mega-ohm elde edilene kadar pistonu sabit tutun. Sonra piston dan kavrama bırakın. Hücrenin gigaseal'ını bekleyin.
Sonra şırıngayı yavaşça kesin. Tüm hücre gerilimi kapılı sodyum akımını kaydetmek için şırınganın üzerine hızlı bir emme musluğu uygulayın. Şırıngayı yavaşça kesmeden önce tüm hücre erişimi elde edilene kadar tekrarlayın.
Daha sonra, tüm hücre kapasitans telafisini açın ve kapasitans ve seri direncini ayarlayın. Seri direnç tazminat açın. 60 mikrosaniye olarak ayarlanmış gecikme ile, seri direnç telafisini ayarlayın ve mühür testini kapatın.
Tam hücre voltaj kapısı sodyum akımının ortalama beş turunu kaydedin. Voltaj kapılı sodyum akımının iki parametresini hızlıca dikkate alın: Pencere akımındaki gerilim ve en yüksek sodyum akımı yoğunluğu. Ortaya alınan eylem potansiyellerini kaydetmek için, modu voltaj kıskacından akım kıskacına geçin.
Epizodik akım kelepçe protokolünü yükleyin. Tutma akımını burada sıfır pikoamp'a ayarlayın ve harici komutu açın. Ortaya çıkarılan eylem potansiyellerini kaydedin.
Bir eylem potansiyelini ateşlemek için enjekte edilen en az akım miktarına dikkat edin. Spontane eylem potansiyellerini kaydetmek için dış komutu kapatın. Boşluksuz akım kelepçesi protokolü yükleyin.
Tutma akımını, bir eylem potansiyeli ateşlemeyen, ortaya çıkan protokoldeki son süpürmede enjekte edilen akım miktarıyla değiştirin. Daha sonra, dış komutu açın. Öngörülen tutma akımının membran potansiyelini bir eylem potansiyeli ateşlemek için eşiğin altına getirdiğini iki kez kontrol edin.
Gerekirse tutma akımını ayarlayın ve spontan aktiviteyi kaydedin. Elektrofizyoloji için optimize edilmiş kültürler tek hücre ve parlak CFP sinyali nezlesi olan küçük kümelerden oluşuyordu. Kültür koşulları optimize edilmediğinde, epitel hücre kültürü büyük kümeler, yüzen hücresel enkaz, hasarlı membranlar ve EC hücrelerindeki zayıf CFP sinyalinden oluşuyordu.
EC'nin tüm hücreleri kolon kültürlerinden girişimlerin %30 artı veya eksi %7'si, jejunum kültüründen gelen girişimlerin ise %41 artı veya eksi %3'ü ile elde edildi. Tüm hücre elektrofizyolojisi ile sodyum akımları jejunumdan TPH-1 CPF pozitif hücrelerinin %81.3 artı veya eksi %4.0'ından ve bunların %64.1 artı veya eksi %9.2'sinden kolondan kaydedildi. Jejunum kültürlerinden 59 AK hücre, mevcut kelepçe modunda 19 EC hücreleri spontan AP ateş, 29 EC hücreleri ap sadece mevcut kelepçe modunda bir adım protokolü ile ortaya çıktığında ATEŞ, ve 11 EC hücreleri ap kendiliğinden veya adım protokolü ateş vermedi.
Bu yordamı çalışırken, birincil epitel kültürleri için en uygun sindirim protokolü kullanımları arasında değişken olabileceğini hatırlamak önemlidir, bu yüzden tek hücre elde etmek için ajitasyon optimal miktarını belirlemek önemlidir. Bu prosedürü takiben, diğer yöntemler, tek hücreli PCR ve floresan gibi, ek sorulara cevap için yapılabilir, ne enterokromfin hücreleri ifade ve nasıl uyaranların hücreler arası sinyalizasyon birleştiğinde gibi. Bu gelişmeden sonra bu teknik, gastrointestinal fizyolojiaraştırmalarının enterokromfin hücrelerinin nasıl çalıştığını ve farelerde gastrointestinal hareketlilik ve salgıyı nasıl düzenlediklerini keşfetmesinin önünü açmıştır.
