يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الفيروسات التهاب الكبد B، مثل العثور على العوامل الخلوية أو الفيروسية التي تؤثر على دمج الحمض النووي لفيروس الورم الحليمي البشري. هناك مزايا متعددة لهذه التقنية. انها رخيصة نسبيا ، وسهلة لتنفيذ ، وتحليل النتائج بسيطة ، وانها حساسة جدا ، وصولا الى نسخ واحدة.
على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن استخدامها لتوفير نظرة ثاقبة في تكامل فيروس التهاب الكبد B، إلا أنه يمكن استخدامها أيضًا في الفيروسات الأخرى التي تندمج في جينوم الخلية المضيفة، مثل فيروس نقص المناعة البشرية أو فيروس نقص المناعة البشرية HTLV-1 أو فيروس الورم الحليمي البشري. لتصيب الخلايا، بذور 200،000 خلية لكل ملليلتر في لوحة 12 جيدا، مع 1 ملليلتر من د-يم. في اليوم التالي، استخدم عمود هيبارين المنقى سو في نا الدين من HEP-AD 38 كما تلقيح لتصيب الخلايا في 1،000 VGE لكل خلية، في 500 ميكرولترات من الثقافة المتوسطة.
ثم، ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية. ثم، في اليوم التالي، وغسل الخلايا مرتين مع ملليلتر واحد من العقيمة مرة واحدة برنامج تلفزيوني. ثم، استبدال الوسط ثقافة كل 2 أيام، حتى الحصاد.
في اليوم 3 بعد العدوى، وعلاج الخلايا مع 5 تينوفوفير ميكرومولار disoproxil و 10 micromolar Lamivudine للحد من إنتاج وسيطة تكرارية HBV التي يتم تضخيم قادرة على عكس PCR. في اليوم 5, بعد العدوى, trypsinize بعض الخلايا مع 200 ميكرولترات من تريبسين EDTA وإعادة تعليقها في 2 ملليلتر من D-mem تحتوي على 5 ميكرومولار Tenofovir disoproxil و 10 micromolar Lamivudine. في وقت لاحق، نقل تعليق الخلية إلى لوحة ستة بئر، للحث على جولة واحدة من الانقسام.
في اليوم 7 بعد العدوى، تبسينيزي الخلايا الموسعة في 400 ميكرولترات من تريبسين EDTA وتعليق الخليط في 1 ملليلتر من مد ميم. ثم، نقل التعليق في أنبوب 1.5 ملليلتر. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 500 مرة G، لمدة خمس دقائق.
وإزالة سو في نا الدين عن طريق الطموح. استخراج الحمض النووي من بيليه الخلية باستخدام عدة استخراج الحمض النووي، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بالنسبة لتحول الحمض النووي، خصص 1.5 إلى 2.5 ميكروغرام من إجمالي استخراج الحمض النووي في أنبوب PCR سعة 200 ميكرولتر.
المقبل, إضافة كمية مناسبة من المزيج الرئيسي انزيم تقييد لنتيجة 40 ميكرولتر من حجم رد الفعل, تحتوي على 1 مرات الهضم العازلة رد فعل و 10 وحدات NCO-1HF. احتضان رد فعل انزيم التقييد في جهاز PCR عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، لتحقيق الكفاءة المثلى في عملية الهضم. ثم، تعطيل إنزيم تقييد عن طريق احتضانه 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
نقل كامل رد فعل انزيم تقييد إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. في وقت لاحق، إضافة 400 ميكرولترات من 1 مرات T4 الحمض النووي رباط العازلة و 500 وحدة من T4 الحمض النووي ligase، واخلط جيدا. حجم التفاعل الكبير يشجع الربط داخل الغدد الحامات من شظايا الحمض النووي هضم.
احتضان تفاعل الربط في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة لضمان الربط الكامل. بعد ساعتين، تعطيل الـ T4 للرابطة في 70 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم أضف 10 ميكرولترات من 10 سلفات دوديسيل صوديوم لضمان تعطيل كامل للرابطة T4.
أضف كلوريد الصوديوم إلى تركيز نهائي يبلغ 100 ملليمولار، وديكستران إلى تركيز نهائي يبلغ 90 ميكروغرام لكل ملليلتر. مزيج من نبض دوامة، وتدور لفترة وجيزة أسفل مزيج رد الفعل. بعد ذلك، أضف 900 ميكرولترات من 100 إيثانول، واخلط بالانقلاب.
يعجل الحمض النووي في درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها. و بيليه الحمض النووي المُعجل عن طريق الطرد المركزي في 14000 مرة G لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، قم بإزالة Su-per-na-dine حسب الطموح.
غسل بيليه مع 500 ميكرولترات من 70 الإيثانول. والطرد المركزي في 14000 مرة G لمدة 15 دقيقة. ثم، إزالة الإيثانول عن طريق الطموح والهواء الجافة بيليه الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
حل بيليه في 20 ميكرولترتر من الماء وإضافة 20 ميكرولترات من المزيج الرئيسي الحد من الانزيم لنتيجة في حجم رد فعل ميكرولتر 40، تحتوي على 1 مرات هضم التفاعل العازلة، 5 وحدات BSIHK-1، و 5 وحدات من SPH-1HF. عش، احتضان رد فعل انزيم تقييد في كتلة الحرارة في 37 درجة مئوية، لمدة 1 ساعة. تدور لفترة وجيزة أسفل مزيج رد الفعل، احتضان رد فعل انزيم تقييد في كتلة الحرارة في 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
في هذا الإجراء، إزالة أمبيركونات المحتملة من ختم حصيرة السيليكون القابلة لإعادة الاستخدام، وذلك باستخدام محلول تدهور الحمض النووي. شطف حصيرة جيدا مع الماء خال من الحمض النووي والهواء الجافة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، إعداد ميليلتر واحد من 1 مرات مزيج PCR تحتوي على التمهيديات الأمامية الأمامية العكسية الخارجية بتركيز 0.5 ميكرومولار.
إضافة 170 ميكرولترات إذا كان 1 مرات مزيج PCR إلى الآبار A-1 و E-1، في لوحة 96 جيدا PCR. ثم، إضافة 120 ميكرولترات من 1 مرات مزيج PCR إلى الآبار B-1 و H-1. بعد ذلك، أضف 10 ميكرولترات من الحمض النووي المقلوب إلى الآبار A-1 و E-1.
مزيج من رد فعل في كل بئر، عن طريق الأنابيب بلطف كل، حوالي 10 مرات باستخدام مجموعة P-1000 إلى 100 ميكرولترات. قم بتخفيف العينات من الآبار A-1 إلى D-1 بشكل متسلسل، بنسبة 1:3 عن طريق نقل 60 ميكرولترات في كل خطوة. اخلط الآبار في كل خطوة عن طريق الأنابيب بلطف حول 10 مرات باستخدام مجموعة P-1000 إلى 100 ميكروليتر.
تجنب تشكيل فقاعات، كرر الإجراء لE-1 جيدا، وتمييع وصولا الى H-1 بشكل جيد. وفي وقت لاحق، خصص 10 ميكرولترات من خليط التفاعل، باستخدام ماصة متعددة القنوات، من ويلز A-1، H-1، إلى آبار A-2 و H2 و A-3 و H-3 وما إلى ذلك، حتى تصل إلى الآبار A-12 و H-12 من 96 بئراً. غطي لوحة PCR بحصيرة سليكون جافة، واضغط بقوة.
ثم، ضع لوحة في جهاز PCR، وتشغيل البرنامج المشار إليه، قبل نقل لوحة إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، سخني دبابيس من 96 دبوس منسوخ إلى أحمر ساخن مع موقد بونسن، ثم يبرد لمدة 5 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة. ملء آبار لوحة PCR الثانية مع 10 ميكرولترات من 1 مرات مزيج PCR، تحتوي على عازلة هلام جاهزة، والداخلية إلى الأمام وعكس في 0.5 ميكروموللار.
إزالة حصيرة السيليكون بعناية من لوحة PCR من لوحة 96 جيدا من PCR الجولة الأولى، وتجنب التلوث المتبادل بين الآبار. استخدام المكرر المبردة لنقل منتجات PCR من لوحة 96 جيدا، من أول جولة PCR، إلى لوحة 96 جيدا المخصصة حديثا. تنفيذ PCR متداخلة، وذلك باستخدام الشرط كما هو مبين.
لعزل منتجات PCR، وتحليلها بواسطة جل الكهربائية، وذلك باستخدام لوحة 96 جيدا، مع 1.3 Agarose هلام. للحصول على هلام أغاروز 100 ملليلتر، تشغيل في 200 فولت لمدة 10 إلى 15 دقيقة. بعد ذلك، استئصال عصابات الحمض النووي من جل أغاروز، وذلك باستخدام قش الشرب المتاح.
لكل منتج PCR، ضع القش و أجاروز هلام سد في أنبوب 1.5 ملليلتر، وتقليم القش إلى حجم مع مقص. بعد ذلك، طرد المقابس Agarose في كل أنبوب، عن طريق الضغط على نهاية جزء القش. ثم إضافة 300 microliters من هلام استخراج العازلة ، وميكرلترات 5 من هلام استخراج الزجاج الخرز لكل أنبوب.
استخراج منتجات PCR لكل تعليمات الشركة المصنعة لمجموعة استخراج هلام، وتمييع الحمض النووي من الخرز مع 30 ميكرولترات من الماء. تقديم الحمض النووي المنقى لتسلسل Sanger ، مع التمهيدي إلى الأمام المستخدمة في الجولة الثانية المتداخلة PCR. مثال Agarose جل electrophoresis من عكسية ناجحة PCR، قبل وبعد عزل المنتج PCR، هو مبين هنا.
M يمثل علامة الحمض النووي الأخيرة، كل صف من 12 يمثل التكرارات التقنية في تخفيف واحد على لوحة PCR. وفي هذه الحالة، ينبغي تحقيق منتجات PCR واحدة من خلال التخفيف من 1:3 ثانية أو الثالثة لكل عينة. في هذه التخفيفات، ما يقرب من 50٪ من المنتجات تمثل وصلات الحمض النووي خلية الفيروس الحقيقي.
في حين أن النصف الآخر يمثل تضخيم وسيطات الحمض النووي HBV. وقد سمحت هذه التقنية للباحثين باستكشاف تكامل الحمض النووي للحم الحليمي البشري في أنظمة العدوى المختبرية الخاضعة للرقابة العالية. يمكن استخدام طرق إضافية، مثل تحليل المعلوماتية الحيوية، للإجابة على المزيد من الأسئلة.
على سبيل المثال، إذا حدث تكامل الحمض النووي HPV في مناطق محددة في الجينوم الخلوي. لا تنس أن العمل مع العدوى فيروس التهاب الكبد B، يمكن أن تكون الضوابط العدوى الخطرة والمناسبة، مثل خزانات السلامة الحيوية والتطعيم المسبق، ينبغي دائما أن تؤخذ أثناء تنفيذ هذه العملية.
