Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés de la virologie de l’hépatite B, comme la recherche de facteurs cellulaires ou virologiques qui influent sur l’intégration de l’ADN du VPH. Cette technique présente de multiples avantages. Il est relativement bon marché, et facile à effectuer, l’analyse des résultats est simple, et il est très sensible, jusqu’à des copies simples.
Bien que cette méthode puisse être utilisée pour donner un aperçu de l’intégration du VHB, elle peut également être utilisée pour d’autres virus qui s’intègrent dans le génome des cellules hôtes, comme le VIH, le HTLV-1 ou le VPH. Pour infecter les cellules, grainez 200 000 cellules par millilitre dans une plaque de douze puits, avec 1 millilitre de D-mem. Le lendemain, utilisez la colonne d’héparine purifiée su-per-na-din de HEP-AD 38 comme inoculant pour infecter les cellules à 1000 VGE par cellule, dans 500 microlitres de milieu culturel.
Ensuite, la culture des cellules à 37 degrés Celsius. Puis, le lendemain, laver les cellules deux fois avec un millilitre de stérile une fois PBS. Ensuite, remplacez le milieu de culture tous les 2 jours, jusqu’à la récolte.
Au jour 3 après l’infection, traiter les cellules avec 5 micromolaires ténofovir disoproxil et 10 micromolaire Lamivudine pour limiter la production d’intermédiaires réplicateurs HBV qui sont amplifiés en mesure par PCR inverse. Au jour 5, après l’infection, trypsiniser certaines cellules avec 200 microlitres de Trypsin EDTA et les suspendre en 2 millilitres de D-mem contenant 5 micromolaires Tenofovir disoproxil et 10 micromolar Lamivudine. Par la suite, transférer les suspensions cellulaires à une plaque de six puits, pour induire une ronde de mitose.
Au jour 7 après l’infection, trypsiniser les cellules élargies dans 400 microlitres de Trypsin EDTA et suspendre le mélange en 1 millileter de D-mem. Ensuite, transférez la suspension dans un tube de 1,5 millilitre. Pelleter les cellules par centrifugation à 500 fois G, pendant cinq minutes.
Et enlever le Su-per-na-din par aspiration. Extraire l’ADN de la pastille cellulaire à l’aide d’une trousse d’extraction d’ADN, selon les instructions du fabricant. Pour l’inversion de l’ADN, allouer 1,5 à 2,5 microgrammes de l’extrait total d’ADN dans un tube PCR de 200 microlitres.
Ensuite, ajoutez la quantité appropriée de mélange principal d’enzyme de restriction pour avoir comme conséquence un microlitre de volume de réaction de 40, contenant 1 fois le tampon de réaction de digestion et 10 unités NCO-1HF. Incuber la réaction enzymatique de restriction dans une machine de PCR à 37 degrés Celsius pendant une heure, pour l’efficacité optimale de digestion. Ensuite, inactivez l’enzyme de restriction en l’incubant à 80 degrés Celsius pendant 20 minutes.
Transférer toute la réaction enzymatique de restriction à un tube de 1,5 millilitre. Par la suite, ajouter 400 microlitres de 1 fois tampon de ligase d’ADN T4 et 500 unités de ligase d’ADN T4, et mélanger soigneusement. Le grand volume de réaction encourage la ligature intramoléculaire des fragments digérés d’ADN.
Incuber la réaction de ligature à température ambiante pendant 2 heures pour assurer une ligature complète. Après 2 heures, inactivez la ligase d’ADN T4 à 70 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ajouter ensuite 10 microlitres de 10 Sulfate de Dodedecyl de sodium pour assurer l’inactivation complète de la ligase T4.
Ajouter le chlorure de sodium à une concentration finale de 100 millimolaires et de Dextran à une concentration finale de 90 microgrammes par millilitre. Mélanger par vortex d’impulsion, et tourner brièvement vers le bas le mélange de réaction. Ensuite, ajoutez 900 microlitres de 100 éthanol et mélangez par inversion.
Précipitez l’ADN à 20 degrés Celsius négatifs pendant la nuit. Et pelleter l’ADN précipité par centrifugation à 14000 fois G pendant 15 minutes. Ensuite, retirez le Su-per-na-dine par aspiration.
Laver la pastille avec 500 microlitres de 70 éthanol. Et centrifugation à 14000 fois G pendant 15 minutes. Ensuite, retirez l’éthanol par aspiration et séchez l’ADN à température ambiante pendant 20 minutes.
Dissoudre la pastille dans 20 microlitres d’eau et ajouter 20 microlitres de mélange maître enzyme limite pour entraîner un volume de réaction de 40 microlitres, contenant 1 fois tampon de réaction de digestion, 5 unités BSIHK-1, et 5 unités de SPH-1HF. Nid, incuber la réaction enzymatique de restriction dans un bloc de chaleur à 37 degrés Celsius, pendant 1 heure. Tournez brièvement vers le bas le mélange de réaction, couver la réaction enzymatique de restriction dans un bloc de chaleur à 65 degrés Celsius pendant 1 heure.
Dans cette procédure, retirez les amplicons potentiels d’un joint réutilisable de tapis de silicium, à l’aide d’une solution de dégradation de l’ADN. Rincez soigneusement le tapis avec de l’eau libre d’ADN et séchez-le à température ambiante. Ensuite, préparez un millileter de 1 fois le mélange PCR contenant les amorces extérieures avant et arrière à une concentration de 0,5 micromolaire.
Ajouter 170 microlitres si le mélange 1 fois PCR aux puits A-1 et E-1, dans une plaque PCR 96 bien. Ensuite, ajoutez 120 microlitres du mélange 1 fois PCR aux puits B-1 et H-1. Par la suite, ajouter 10 microlitres de l’ADN inversé aux puits A-1 et E-1.
Mélanger la réaction dans chaque puits, en pipetting doucement chacun, environ 10 fois à l’aide d’un P-1000 réglé à 100 microlitres. Diluer périodiquement les échantillons des puits A-1 à D-1, à un rapport de 1:3 en transférant 60 microlitres à chaque étape. Mélangez les puits à chaque étape en les pipetting doucement environ 10 fois à l’aide d’un P-1000 réglé à 100 microlitres.
Évitez de former des bulles, répétez la procédure pour bien E-1, diluant vers le bas au puits H-1. Par la suite, allouer 10 microlitres du mélange de réaction, à l’aide de pipette multicanal, de Wells A-1, H-1, dans les puits A-2, H2, A-3, H-3 et ainsi de suite, jusqu’à atteindre les puits A-12, H-12 de la plaque de puits 96. Couvrir la plaque PCR d’un tapis de silicium sec et presser fermement.
Ensuite, placez la plaque dans une machine PCR, et exécutez le programme indiqué, avant de transférer la plaque à température ambiante. Ensuite, chauffer les broches d’un réplicateur de 96 broches à rouge-chaud avec un brûleur Bunsen, puis refroidir pendant au moins 5 minutes à température ambiante. Remplissez les puits d’une deuxième plaque PCR de 10 microlitres de 1 fois le mélange PCR, contenant un tampon prêt pour la charge de gel, et l’avant intérieur et l’inverse à 0,5 micromolaire.
Retirez soigneusement le tapis de silicium de la plaque PCR de la plaque de puits 96 du PCR premier tour et évitez la contamination croisée entre les puits. Utilisez le réplicateur refroidi pour transférer les produits PCR de la plaque de puits 96, du PCR de premier tour, à la plaque de puits nouvellement allouée 96. Effectuer le PCR imbriqué, en utilisant la condition comme indiqué.
Pour isoler les produits PCR, analysez-les par électrophorèse gel, à l’aide d’une plaque de puits 96, avec 1,3 gel Agarose. Pour un gel Agarose de 100 millilitres, courir à 200 volts pendant 10 à 15 minutes. Par la suite, exciser les bandes d’ADN des gels Agarose, à l’aide de pailles jetables à boire.
Pour chaque produit PCR, placez la paille et le bouchon de gel Agarose dans un tube de 1,5 millilitre, coupez la paille en taille avec des ciseaux. Par la suite, éjecter les bouchons d’Agarose dans chaque tube, en pressant à l’extrémité du fragment de paille. Ajouter ensuite 300 microlitres de tampon d’extraction de gel, et 5 microlitres de perles de verre d’extraction de gel à chaque tube.
Extraire les produits PCR par fabricant des instructions pour le kit d’extraction de gel, et diluer l’ADN des perles avec 30 microlitres d’eau. Soumettez l’ADN purifié pour le séquençage Sanger, avec l’amorce avant utilisée dans le PCR imbriqué du deuxième tour. Un exemple agarose gel électrophoresis de PCR inverse réussi, avant et après l’isolement du produit PCR, est montré ici.
M représente le marqueur d’ADN dernier, chaque ligne de 12 représente les répliques techniques à une dilution unique sur la plaque PCR. Dans ce cas, les produits PCR simples doivent être atteints par la deuxième ou la troisième dilution 1:3 de chaque échantillon. À ces dilutions, environ 50 % des produits représenteront de véritables jonctions d’ADN de cellules virales.
Tandis que l’autre moitié représente l’amplification des intermédiaires d’ADN de HBV. Cette technique a permis aux chercheurs d’explorer l’intégration de l’ADN du VPH dans des systèmes d’infection in vitro hautement contrôlés. D’autres méthodes, telles que l’analyse biothématique, peuvent être utilisées pour répondre à d’autres questions.
Par exemple, si l’intégration de l’ADN du VPH se produit dans des régions spécifiques du génome cellulaire. N’oubliez pas que le travail avec le virus de l’hépatite B peut être dangereux et des contrôles appropriés des infections, tels que les armoires de biosécurité et la vaccination préalable, doivent toujours être prises lors de l’exécution de ces procédures.
