Bu yöntem, HPV DNA entegrasyonunu etkileyen hücresel veya virolojik faktörlerin bulunması gibi Hepatit B virolojisinde anahtar soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin birden çok avantajı vardır. Nispeten ucuz ve gerçekleştirmek kolay, sonuçların analizi basit, ve çok hassas, aşağı tek kopya.
Bu yöntem HBV entegrasyonu hakkında bilgi sağlamak için kullanılabilse de, hiv, HTLV-1 veya HPV gibi konak hücre genomuna entegre olan diğer virüsler için de kullanılabilir. Hücreleri enfekte etmek için, tohum 200,000 mililitre başına mililitre başına on iki kuyu plaka, D-mem 1 mililitre ile. Ertesi gün, HEparin sütunu, 500 mikrolitre kültür ortamında hücre başına 1,000 VGE'deki hücrelere bulaşmasını inokülant olarak HEP-AD 38'den saflaştırılmış su-per-na-din kullanın.
Sonra, 37 santigrat derecedeki hücreleri kültüre. Sonra, ertesi gün, steril bir mililitre ile iki kez hücreleri yıkayın bir kez PBS. Daha sonra, hasat kadar, her 2 günde bir kültür ortamı değiştirin.
Gün 3 sonrası enfeksiyon, hücreleri tedavi 5 mikromolar tenofovir disoproxil ve 10 mikromolar Lamivudine ters PCR ile yükseltmek mümkün HBV çoğaltıcı ara üretimini sınırlamak için. Gün 5, post enfeksiyon, Tripsin EDTA 200 mikrolitre ile bazı hücreleri trypsinize ve 5 mikromolar Tenofovir disoproxil ve 10 mikromolar Lamivudin içeren D-mem 2 mililitre onları askıya. Daha sonra, mitoz bir tur neden olmak için, altı iyi plaka hücre süspansiyonlar aktarın.
7. gün enfeksiyon sonrası, 400 mikrolitre Trypsin EDTA'da genişletilmiş hücreleri deneyin ve karışımı 1 milileter D-mem'de askıya alın. Daha sonra süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. 500 kez G santrifüj ile hücreleri pelet, beş dakika.
Ve aspirasyon ile Su-per-na-din kaldırın. Üreticinin talimatına göre, dna çıkarma kiti kullanarak hücre peletinden DNA ayıklayın. DNA inversiyon için, 200 mikrolitrelik BIR PCR tüpüne toplam DNA ekstresinin 1,5 ila 2,5 mikrogramını ayırın.
Daha sonra, 1 kez sindirim reaksiyonu tamponu ve 10 birim NCO-1HF içeren 40 mikrolitre reaksiyon hacmine neden olmak için uygun miktarda restriksiyon enzimi ana karışımı ekleyin. Optimum sindirim verimliliği için 37 santigrat derecede bir PCR makinesinde restriksiyon enzim reaksiyonu inkübül. Daha sonra, 20 dakika boyunca 80 santigrat derece kuluçka ya da restriksiyon enzimini inaktive edin.
Tüm restriksiyon enzim reaksiyonu 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra, 1 kez T4 DNA ligaz tampon ve T4 DNA ligaz 500 birimleri 400 mikrolitre ekleyin ve iyice karıştırın. Büyük reaksiyon hacmi sindirilmiş DNA parçalarının intramoleküler ligasyonteşvik eder.
Tam ligasyon sağlamak için 2 saat oda sıcaklığında ligasyon reaksiyonu kuluçka. 2 saat sonra, T4 DNA ligazını 70 derecede 20 dakika süreyle inaktive edin. Daha sonra, T4 ligase tam inaktivasyonu sağlamak için 10 Sodyum Dodedecyl Sülfat 10 mikrolitre ekleyin.
Sodyum Klorür'ü 100 milimolar son konsantrasyonuna ve Dextran'ı mililitre başına 90 mikrogramlık son konsantrasyona ekleyin. Darbe girdap tarafından karıştırın ve kısaca reaksiyon karışımı aşağı spin. Sonra, 100 etanol 900 mikrolitre ekleyin ve inversion tarafından karıştırın.
DNA'yı bir gecede negatif 20 derecede çökeltin. Ve 15 dakika boyunca 14000 kez G'de santrifüj ile çökelmiş DNA'yı pelet. Daha sonra, aspirasyon ile Su-per-na-dine kaldırın.
Peleti 500 mikrolitre 70 etanolile yıkayın. Ve 15 dakika için 14000 kez G santrifüj. Daha sonra, aspirasyon ile Etanol çıkarın ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında DNA pelet hava kuru.
Peleti 20 mikrolitre suda çözün ve 1 kez sindirim reaksiyonu tamponu, 5 ünite BSIHK-1 ve 5 ünite SPH-1HF içeren 40 mikrolitrelik reaksiyon hacmine yol açacak şekilde 20 mikrolitre kısıtlayıcı enzim ana karışımı ekleyin. Yuva, 37 santigrat derecede bir ısı bloğunda restriksiyon enzim reaksiyonu kuluçka, 1 saat. Kısaca reaksiyon karışımı aşağı spin, 1 saat boyunca 65 santigrat derece bir ısı bloğu nda kısıtlama enzim reaksiyonu kuluçka.
Bu işlemde, DNA bozunma çözeltisi kullanarak yeniden kullanılabilir silikon paspas contasından potansiyel amlikonları çıkarın. Paspası DNA'sız su yla iyice durulayın ve oda sıcaklığında kurulayın. Daha sonra, 0,5 mikromolar konsantrasyonda dış ileri ve ters astariçeren 1 kez PCR karışımı bir milileter hazırlayın.
96 iyi PCR plakalı wells A-1 ve E-1'e 1 kez PCR karışımı varsa 170 mikrolitre ekleyin. Daha sonra B-1 ve H-1 kuyularına 1 kez PCR karışımının 120 mikrolitresini ekleyin. Daha sonra, A-1 ve E-1 kuyularına ters DNA'dan 10 mikrolitre ekleyin.
Her kuyudaki reaksiyonu, her bir kuyuda, 100 mikrolitreye kadar bir P-1000 seti kullanarak yaklaşık 10 kez borulama yaparak karıştırın. Her adımda 60 mikrolitre aktararak 1:3 oranında, A-1'den D-1'e kadar olan kuyulardan alınan numuneleri seri olarak seyreltin. 100 mikrolitreye ayarlanmış bir P-1000'i kullanarak her adımda kuyuları yaklaşık 10 kez borulandırarak karıştırın.
Kabarcıklar şekillendirme kaçının, iyi E-1 için prosedürü tekrarlayın, iyi H-1 aşağı seyreltme. Daha sonra, wells A-1, H-1, wells A-2, H2, A-3, H-3 ve benzeri içine çok kanallı pipet kullanarak reaksiyon karışımı 10 mikrolitre ayırın, kuyua ulaşana kadar A-12, H-12 96 kuyu plaka. PCR plakasını kuru silikon paspasile kaplayın ve sıkıca bastırın.
Daha sonra, plakayı bir PCR makinesine yerleştirin ve plakayı oda sıcaklığına aktarmadan önce belirtilen programı çalıştırın. Daha sonra, bir Bunsen brülör ile kırmızı-sıcak bir 96 pin çoğaltıcı pimleri ısı, sonra oda sıcaklığında en az 5 dakika serin. İkinci bir PCR plakasının kuyularını 1 kat PCR karışımının 10 mikrolitresi ile doldurun, jel yük hazır tampon içeren, ve 0,5 mikromolar iç ileri ve geri.
İlk yuvarlak PCR'den 96 kuyu plakasının PCR plakasından silikon paspası dikkatlice çıkarın ve kuyular arasında çapraz kontaminasyonu önleyin. İlk tur PCR'den yeni ayrılan 96 kuyu plakasına 96 kuyu plakasının PCR ürünlerini aktarmak için soğutulmuş çoğaltıcıyı kullanın. Belirtildiği gibi koşulu kullanarak iç içe pcr gerçekleştirin.
PCR ürünleri izole etmek için, jel elektroforez ile analiz, bir kullanarak 96 iyi plaka, ile 1.3 Agarose jel. 100 mililitrelik Agarose jel için, 10 ila 15 dakika 200 volt çalıştırın. Daha sonra, tek kullanımlık içme pipetleri kullanarak Agarose jellerinden DNA bantlarını çıkarın.
Her PCR ürünü için, saman ve Agarose jel fişini 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin, samanları makasla boyuta küçültün. Daha sonra, saman parçasının ucunda sıkıştırarak, her tüp içine Agarose fişleri çıkarmak. Sonra jel ekstraksiyon tampon 300 mikrolitre ekleyin ve her tüp jel ekstraksiyon cam boncuk 5 mikrolitre.
Jel ekstraksiyon kiti için üreticinin talimatları başına PCR ürünleri ayıklayın ve su 30 mikrolitre ile boncuk DNA seyreltmek. Sanger dizilimi için saflaştırılmış DNA'yı gönderin, ikinci turda iç içe pcr'de kullanılan ileri astarı ile. Başarılı ters PCR'nin Agarose jel elektroforezi, PCR ürün izolasyonundan önce ve sonra burada gösterilmiştir.
M DNA işaretçisi ikinci temsil eder, 12 her satır PCR plaka üzerinde tek bir seyreltme teknik çoğalır temsil eder. Bu durumda, tek PCR ürünleri her numunenin ikinci veya üçüncü 1:3 seyreltilmesi ile elde edilmelidir. Bu seyreltmelerde, ürünlerin yaklaşık %50'si gerçek virüs hücresi DNA bağlantılarını temsil edecektir.
Diğer yarısı HBV DNA ara larının amplifikasyon temsil ederken. Bu teknik, araştırmacıların yüksek kontrollü in-vitro enfeksiyon sistemlerinde HPV DNA entegrasyonunu keşfetmelerine olanak sağlamıştır. Diğer soruları yanıtlamak için biyotematik analizi gibi ek yöntemler kullanılabilir.
Örneğin, HPV DNA entegrasyonu hücresel genomun belirli bölgelerinde gerçekleşirse. Enfeksiyon Hepatit B virüsü ile çalışan, tehlikeli olabilir ve uygun enfeksiyon kontrolleri olabilir unutmayın, biyo güvenlik dolapları ve ön aşılama gibi, her zaman bu prosedürü gerçekleştirirken alınmalıdır.
