بروتوكول أخذ العينات غير متحيزة أمر حيوي للمجهر الإلكترون. إذا كنت ترغب في قياسها على الكثافة العددية للتشابك أو الهياكل الأخرى في منطقة معينة من الدماغ، فإن الميزة الرئيسية لتقنيتنا هي أنها غير متحيزة، وتمكن من إنتاج ميكروغرافيات إلكترونية تلقائيًا مع الحد الأدنى من تدخل المستخدم. هذه التقنية هي أيضا قيمة في مجالات بحثية أخرى، مثل علم الأعصاب، حيث يمكن استخدامها في تقييم قوة الشبكة العصبية.
من أجل تطبيق بروتوكولنا، من الضروري أن يكون لديك خبرة في التقنيات المجهرية الإلكترونية، مثل إعداد العينة وتشغيل المجهر الإلكتروني الانتقالي. إثبات إجراءنا سيكون الدكتور ستيفان Wernitznig، بعد وثيقة من مختبري. يتكون هذا البروتوكول من إعداد عينات الدماغ للمجهر الإلكتروني، وقطع أزواج من أجزاء رقيقة.
بعد ذلك، سوف يصف كيفية إنتاج عدد محدد من الإلكترونيات الدقيقة تلقائياً في منطقة ذات أهمية. ثم، فإنه سيتم استخدام إطار العد لتقييم الكثافة العددية للملامح الهيكلية. للبدء، تشريح، إصلاح، بعد الإصلاح، وتضمين عينات من الفائدة في الراتنج تضمين باتباع جنبا إلى جنب مع بروتوكول النص المصاحب.
ثم، ضع العينة على استئصال فائق الشعر وإنتاج 55 نانومتر مقاطع تسلسلية رقيقة للغاية. وضع المقاطع على شبكة فتحة مع أبعاد ملليمتر واحد من اثنين ملليمتر، المغلفة مع شكل piola. ثم، قم باحتواء المقاطع الرقيقة جدًا على شبكات الفتحة باستخدام 2٪ من أسيتات أورانيل لمدة 30 دقيقة، متبوعة بسيترات الرصاص لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
ضع الشبكة في TEM وتفحص الأقسام على الشبكة باستخدام TEM باستخدام التكبير المنخفض لتوجيه وتقييم جودة المقاطع. ثم، بدء تشغيل البرنامج المقطع التسلسلي TEM، حدد المقطع واختر إدراج لإضافة نقاط الزاوية للمرجع والبحث القسم. اتبع التعليمات الخاصة بالإطار المنبثق.
ابدأ بالمقطع المرجعي ثم تابع المقطع البحث. تأكد من أن حواف المقطع متوازية مع المقطع التالي، حيث يتم إدخال النقاط الأولى والنقاط اثنين. تصور بعد ذلك المقطع المرجعي تحت التكبير المنخفض لتحديد المنطقة ذات الاهتمام.
نقل مرحلة المجهر باستخدام تحليل صورة TEM على قسم المرجع إلى نقاط الزاوية متعددة من العائد على الاستثمار لإنشاء مخطط لعائد الاستثمار. تسجيل إحداثيات المضلع الناتج باستخدام برنامج أخذ عينات نقطة عشوائية. لهذا، اضغط إضافة إحداثيات في مربع الحوار من برنامج أخذ عينات نقطة عشوائية عند كل نقطة من المضلع المطلوبة لتوضيح عائد الاستثمار في المقطع.
بعد ذلك تحديد وإدخال حجم مناسب لمناطق أخذ العينات والمسافات بين المناطق في برنامج أخذ العينات نقطة عشوائية. ثم اضغط على حساب النقطية لتوليد إحداثيات بطريقة منهجية وموحدة وعشوائية لمواقف ميكروجراف داخل المضلع. تخزين نقاط أخذ العينات على قسمي المرجع والبحث، باستخدام برنامج "أخذ عينات نقطة عشوائية" وبرنامج المقطع التسلسلي TEM.
هذه هي إحداثيات المونتاجات التي يتم تسجيلها بعد ذلك. في برنامج أخذ العينات نقطة عشوائية، اضغط على الانتقال إلى الموضع التالي لنقل مرحلة المجهر إلى س، إحداثيات ص من كل منطقة أخذ العينات في المقطع المرجعي. ثم حدد الموقع ثم اختر إدراج لاستيراد هذه الإحداثيات في برنامج المقطع التسلسلي TEM في المقطع المرجعي.
كرر هذا لكافة الإحداثيات. لعكس الإحداثيات من مقطع المرجع إلى قسم البحث، حدد المقطع واختر الانتقال إلى المقطع. أدخل رقم مقطع البحث في نافذة الحوار.
لتسجيل المونتاج، قم بالتبديل بين قسم المرجع والبحث، كما هو موضح من قبل، ثم قم بتغيير الموضع على المقطع المرجعي مع الموقع والانتقال إلى الرقم. اختر الإحداثي التالي في نافذة الحوار. للمونتاج SerialEM، في كل إحداثيات أخذ العينات، انتقل إلى ملف واختر المونتاج الجديد من القائمة المنسدلة.
حدد العدد الصحيح من اللوحات والنسبة المئوية للتداخل في نافذة الحوار. بالنسبة لهذه الدراسة، فإن تكبير 5000 يكفي للتعرف على السمات المتشابكة على الدراسة. ولكن مجال محدود من عرض الكاميرا CCD المطلوبة جعل المونتاج من اثنين من الصور.
يتم إجراء المونتاجات إلى SerialEM. قبل تسجيل كل مونتاج، قم بإعادة ضبط التركيز أو تنشيط خيار التركيز التلقائي في برنامج التسجيل. اختيار المجلد لحفظ ملف المونتاج وبدء تسجيل المونتاج عن طريق الضغط على ابدأ في القائمة الفرعية المونتاج ، على اليسار في SerialEM.
بدء تشغيل microdissector وتحديد حجم إطار العد وعدد من القطع حسب الحاجة. حساب كثافة المشبك باستخدام ماكرو التشريح. باستخدام أداة متعددة النقاط الموجودة في شريط الأدوات، والحد من تلك نقاط الاشتباك العصبي التي تتقاطع مع خطين ممنوعين من تشريح، ولكن لا عد نقاط الاشتباك العصبي على خطوط القبول المعاكس.
وضع علامة على كل المشبك داخل إطار العد الذي يكون مرئياً في قسم المرجع، ولكنه غير مرئي في قسم البحث، مع تحديد بيضاوي. لقياس المعلمات المشبك، حدد فقط نقاط الاشتباك العصبي مع شق متشابك المنحى في المقطع المقطع الذي هو على المقطع المرجعي. وينبغي أن يكون هذا ضمن إطارات الصور نفسها المستخدمة لتشريح.
المقبل، انتقل إلى الإضافات ومن ثم لتحليل وبدء البرنامج المساعد ObjectJ من القائمة المنسدلة. فتح مشروع جديد من مربع الحوار المنسدل ObjectJ الذي سيفتح نافذة تسمح للمستخدم لتحديد الهياكل ووضع علامة باستخدام أداة العلامة. أولاً، استخدم أداة العلامة لقياس طول الغشاء قبل التشابك وطول الكثافة ما بعد متشابك عن طريق رسم خط على طول الهيكل.
ثم، الحصول على متوسط عرض الشق متشابك عن طريق رسم مضلع، تغطي كل من الغشاء قبل وبعد متشابك. لتحديد عدد من الإرساء فياحل، عد جميع الحواشي التي لديها أقصى مسافة من الغشاء قبل متشابك من قطر واحد أو أقل من vesicle. ثم، تحديد عدد من vesicles غير مفكك عن طريق عد الفُيْضَيَّة مع مسافة قصوى من قطر واحد من رست أو غيرها من الفُيْيْسَة في نفس المشبك.
تسمح نسخة مكيفة من البروتوكول بتحليلات عنصرية في مواقع تم الحصول عليها بشكل غير متحيز داخل القسم الرقيق للغاية. لهذا، في وضع التصوير TEM بدء SerialEM ثم فتح مشروع جديد. ثم، افتح المستكشف وتحقق من إعدادات الكاميرا في الكاميرا وضوابط البرنامج النصي للعرض وتسجيل وعرض ابدأ.
لإنشاء خريطة زاوية للقسم فائقة الوضوح، اختر إضافة نقاط في نافذة المتصفح. ثم، تعيين نقاط الزاوية على حواف مقطع رقيقة جدا. نقل المرحلة إلى نقطة زاوية من خلال الضغط باستمرار على مفتاح الماوس الأيمن.
عند الوصول إلى زاوية من القسم، أضف نقطة زاوية بنقرة ماوس يسرى. كرر الإجراء لإضافة ثلاث نقاط أخرى في الزاوية. تأكد من أن المربع C لنقاط الزاوية في نافذة Navigator، يتم تحديد النقاط المخزنة.
لبدء المونتاج الزاوية، انتقل إلى Navigator في شريط قائمة SerialEM واختر مونتاج من قائمة مونتاج في ركن الإعداد من القائمة المنسدلة. اختر إضافة مضلع في نافذة Navigator وحدد المنطقة التي تهمك بنقرات الماوس اليمنى المتعددة. بعد ذلك، اختر إضافة شبكة من النقاط في القائمة المنسدلة المستكشف وحدد المسافة بين النقاط.
بدء البرنامج النصي EFTEMSerialEM اتبع أوامر البرنامج النصي أدخل عدد نقاط الشبكة كما هو موضح في المستكشف وأدخل عدد نقاط الاكتساب. ثم قم بتعيين عتبة الإضاءة بحيث يمكن للبرنامج النصي تجنب أشرطة الشبكة. اتبع أوامر البرنامج النصي ونقل المرحلة يدويا لتغطية مجال العرض من قبل ربع شريط الشبكة.
وفقًا للقيمة المعروضة، أدخل قيمة إضاءة العتبة التي تكون أعلى من القيمة المعروضة. انتظر حتى يتم تحديد نقاط للحصول على الطعام ويتم الانتهاء من روتين الطهي. هذا يستغرق وقتا طويلا ويمكن القيام به بين عشية وضحاها.
بعد إعداد لتحليل عنصر TEM المصفى للطاقة، احصل على خريطة عنصرية مع إعدادات خاصة بعنصر معين. نهج أخذ العينات غير المتحيزة مفيد في عد وتحليل السمات المتشابكة في مناطق معينة من الدماغ. بالإضافة إلى ذلك، يسمح البرنامج النصي EFTEMSerialEM لبرنامج SerialEM واحد عشوائياً اختيار نقاط الاستحواذ من داخل قسم كامل رقيقة جداً، بهدف الحصول على ميكروجراف الإلكترون تصفية الطاقة في كل من هذه النقاط.
حدد البرنامج النصي بشكل عشوائي عددًا من النقاط، تم تحديدها مسبقًا من قبل المستخدم من تلك التي تم وضع علامة عليها مع التقدير. من خلال إنتاج ميكروجراف اختبار والتحقق من مستويات الصف، والتحقق من السيناريو إذا كانت النقاط المختارة كانت موجودة على جزء مرئي من القسم، ورفض النقاط التي هبطت على أشرطة الشبكة. تمت معالجة معظم سير العمل من خلال البرنامج النصي، مع الحد الأدنى من التفاعل للمستخدم.
ومع ذلك، مع النموذج المعروض هنا، كان هناك ضوء قليلاً جداً روتين التركيز التلقائي من SerialEM. لذلك، بمجرد أن نقل السيناريو المرحلة إلى كل نقطة، تم تعديل التركيز وخريطة عنصرية مصنوعة من الحديد. ومن المهم أن يتم بعناية اختيار المنطقة موضع الاهتمام وضمان أن يقع نفس عدد نقاط أخذ العينات في كل مجال من مجالات الاهتمام.
لا ننسى أن العديد من المواد الكيميائية المستخدمة لإعداد العينات هي سامة. لذا ارتدي معطف المختبر والقفازات الواقية و اعملي تحت غطاء الدخان
