إن الكيمياء المناعية الكاملة هي تقنية سريعة وبسيطة نسبيًا تسمح بالملاحظة المكانية والزمانية للبروتينات مباشرة في الأنسجة أو الكائن الحي باستخدام أجسام مضادة تحمل علامات. فائدة هذه التقنية هي أنها تسمح لتلطيخ نسيج سليم أو كائن حي دون الحاجة إلى القسم الأول ويمكن استخدام المجهر الناسج لتوليد تمثيل ثلاثي الأبعاد لنمط التعبير البروتيني. يستخدم علم الكيمياء المناعية على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية لفهم المسببات والآليات الجزيئية التي تكمن وراء المرض.
كما أنها أداة تشخيصية قيمة لتحديد الأورام في العينات المرضية. للبدء، إعداد خزانات التفريخ مليئة بالماء النظام ومع شبكة أو بطانة مشقوق في مكان. وضع حمار وحشي الكبار مختلطة أزواج الجنس في مجموعات في الدبابات بين عشية وضحاها.
استخدم دورة ضوئية/داكنة لمدة 14 ساعة/10 ساعات مع إضاءة 9 .m. في صباح اليوم التالي، مع الأضواء على، وتغيير مياه خزان تفريخ مع المياه النظام العذب لإزالة البراز. مرة واحدة يتم وضع البيض، والعودة الكبار إلى الدبابات المنزل.
جمع البيض عن طريق رسمها باستخدام ماصة نقل. نقل 50 بيضة إلى كل طبق بيتري مليئة في منتصف الطريق مع متوسط الجنين. إزالة أي بيض مبهمة وغائمة التي هي ميتة أو فشل في تقسيم.
احتضان طبق البيض في 28.5 درجة مئوية حتى 23 ساعة بعد الإخصاب. إذا كانت الأجنة أكبر من 24 ساعة بعد الإخصاب، مع ماصة نقل الأجنة إلى 200 وحدة حرارية بريطانية ميكرومولار في متوسط الجنين لمنع تكوين الميلانوجين. تحت مجهر ستيريو، اغفور الأجنة غير المهزّم باستخدام ملقط طرف فائقة الدقة.
باستخدام ماصات باستور المصقولة بالنيران لتقليل الضرر ، قم بنقلها إلى أطباق بيتري زجاجية أو بلاستيكية مغلفة بنسبة 1-2٪agarose المذابة في وسط الجنين. ثم نقل الأجنة إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي 1.5 ملليلتر باستخدام ماصة بلاستيكية أو مصقولة على النار. إزالة متوسط الجنين مع ميكروسيبيت.
اتركي سائلاً كافياً فقط لتغطية الأجنة فقط. إصلاح الأجنة في 4٪ PFA لمدة ساعة إلى ساعتين مع هزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بغسل الأجنة ثلاث مرات في برنامج PBS 1X و1٪ PBTriton لمدة خمس دقائق.
استخدم الأجنة على الفور أو قم بتخزينها عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. للتخزين على المدى الطويل، وتجفيف وتخزين الأجنة في الميثانول 100٪ في ناقص 20 درجة مئوية. لإعادة هيدرات الأجنة، قم بإجراء حضانات متسلسلة خمس دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة مع انخفاض كميات الميثانول وبرنامج تلفزيوني وPPTriton للغسيل النهائي.
المضي قدما في إعداد الجنين وفقا للمخطوطة. حدد حل حظر مطابقة الأنواع المضيفة للأجسام المضادة الثانوية، على سبيل المثال مصل الماعز 10٪ في PBTriton مع أو بدون ملليغرام لكل ملليلتر من BSA. إضافة 0.5 ملليلتر من محلول الحجب في الأنبوب الذي يحتوي على الجنين ووضع الأنبوب على الروك لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة.
ثم احتضان الجنين في الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول الحجب وPPTriton بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية أثناء الهزاز. في الصباح، يغسل الجنين خمس مرات في PBTriton لمدة 10 دقائق في كل درجة حرارة الغرفة أثناء هزاز. ثم حدد الأجسام المضادة الثانوية على أساس الأنواع المضيفة للجسم المضاد الأساسي والطول الموجي المطلوب عند 488 نانومتر.
أضف الجسم المضاد الثانوي المخفف في محلول الحجب في الأنبوب الذي يحتوي على الجنين. تغطية أنبوب مع رقائق الألومنيوم واحتضان لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في حين هزاز. بعد ذلك ، قم بغسل الأجنة ثلاث مرات في PBTriton لمدة 10 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة أثناء تغطيتها برقائق الألومنيوم وهزاز.
مع ماصة، نقل الأجنة إلى محلول الجلسرين 50٪ في برنامج تلفزيوني على سرير من 2٪ agarose في متوسط الجنين. لإزالة صفار، نقل 200 ميكرولترات من 1X PBS إلى شريحة الاكتئاب أو شريحة الزجاج العادي. استخدم ماصة نقل بلاستيكية لنقل جنين أو أكثر إلى قطرات PBS.
استخدام ملقط فائقة غرامة ودبابيس مزدوجة صفر دبابيس الحشرات لكسر صفار وكشط جدا بلطف حبيبات صفار من السطح البطني للجنين. إزالة حبيبات صفار وتجديد مع برنامج تلفزيوني حسب الحاجة. بعد التركيب، ضع العينة على مرحلة المجهر.
حدد موقع المنطقة ذات الأهمية عن طريق اختيار مثال مشرق نسبيا. ضبط التعرض للكاميرا وكسب بحيث إشارة مشرقة بما فيه الكفاية دون تشبع. عند المقارنة بين الأجنة التجريبية التي تحمل علامات الأجسام المضادة والتحكم في الأجنة المضادة، استخدم نفس إعدادات التعرض.
هذا البروتوكول من كامل جبل المناعة هيستوتشيستريا أداة قيمة لدراسة التعبير عن البروتين المكاني والزماني باستخدام تطوير سمك الحمار الوحشي. كشفت الوحدة الفرعية GluN1 من مستقبلات الغلوتامات من نوع NMDA عن التعبير عن وحدات فرعية لمستقبلات الغلوتامات في جميع أنحاء تطوير عضلات الحمار الوحشي في 23 ساعة بعد الإخصاب. تم تركيب أجزاء مجمدة من أجنة الإخصاب لمدة 72 ساعة على الشرائح والمصابة بالمناعة للفوسفو-H3، وهي علامة على الخلايا المتكاثرة.
وأعربت عدة خلايا عن فوسفو-H3 وكان التعبير الأكثر بروزا في المناطق البطينية. كشف جسم مضاد التحكم في IgG الماوس واستبعاد الأجسام المضادة الأولية مستوى منخفض من التعبير غير محددة. من المهم تحديد حلول الحجب المناسبة والأجسام المضادة الثانوية استنادًا إلى الأنواع المضادة الرئيسية المضيفة لضمان الكشف عن البقع غير المحددة وتقليلها.
يجب التحقق من علم المناعة لضمان أن الإشارة التي لوحظت هي في الواقع البروتين من الفائدة. وعادة ما تنطوي تجارب المتابعة على استخدام كائنات معدلة وراثيا أو بيئيا. تمنح الكيمياء المناعية الباحثين القدرة على مراقبة البروتينات في الموقع ، مما يسرع إلى حد كبير فهمنا للعديد من الأنظمة في كل من البيولوجيا الأساسية والتطبيقية خاصة أثناء نمو الجنين.
الميثانول والفورمالديهايد سامان وينبغي التعامل مع بعناية. وينبغي جمع النفايات والتخلص منها وفقاً للإجراءات المؤسسية.
