Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo della meccanobiologia, come il modo in cui le forze vengono trasmesse e percepiti all'interno delle cellule, nonché tra le cellule e il loro ambiente. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'accesso alle informazioni su scala molecolare su come le proteine rispondono alle forze meccaniche all'interno del contesto nativo della cellula vivente. Sebbene questo metodo sia stato applicato specificamente allo studio della vinculina della proteina dell'adesione focale, può anche essere applicato ad altre proteine meccanicamente sensibili, come talina, caderine o nesprina.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché una corretta configurazione dell'imaging è difficile ma necessaria per il successo dell'analisi. Iniziare questa procedura con l'espressione stabile del costrutto del sensore di tensione nel tipo di cella desiderato, come descritto nel protocollo di testo. Per preparare i substrati per la semina cellulare, acquisire quattro piatti con fondo di vetro da 35 millimetri.
Lavorando in una cappa di coltura cellulare, in un tubo conico da 15 millilitri, fare quattro millilitri da 10 microgrammi per fibronectina millilitro in soluzione salina sterile tamponata con fosfato, o PBS. Invertire delicatamente il tubo una volta per mescolare e lasciare riposare la soluzione per cinque minuti nel cappuccio di coltura cellulare. Quindi pipettare un millilitro di soluzione di fibronectina su ogni piatto con fondo di vetro.
Lasciare la soluzione di fibronectina sui piatti per un'ora a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Quindi aspirare la soluzione di fibronectina e risciacquare una volta con PBS. Lasciare un millilitro di PBS sui piatti fino a quando le cellule non sono pronte per la semina.
Dopo aver contato le cellule, seminare 30.000 cellule su ogni piatto di vetro rivestito di fibronectina con il mezzo completo appropriato per un volume finale di 1,5 millilitri. Lasciare che le cellule si diffondano per quattro ore dopo la semina. A due ore di diffusione, aspirare i mezzi di crescita e risciacquare una volta con i mezzi di imaging.
Lasciare 1,5 millilitri del supporto di imaging. Riscaldare il microscopio come descritto nel protocollo di testo prima di iniziare la calibrazione. Per calibrare il laser FRAP, aprire prima la finestra di configurazione laser.
Impostare l'impostazione Illuminazione sulle impostazioni di illuminazione FRAP appropriate per l'esposizione laser al campione. Quindi impostare l'impostazione Illuminazione sulle impostazioni di illuminazione appropriate per l'imaging solo del fluoroforo accettore. Selezionate l'obiettivo da calibrare in Impostazione sistema coordinate (Coordinate system).
Deselezionare Fare clic manualmente sui punti di calibrazione e selezionare Visualizza immagini durante la calibrazione. Impostate il tempo di divaro su 10.000 microsecondi e il numero di impulsi su 100. Ora posizionare la diapositiva di calibrazione, fatta di bromuro di etidio sigillato tra uno scivolo di vetro e uno scivolo di copertura, nell'adattatore del palco con il lato di scorrimento del coperchio verso il basso.
Utilizzare le impostazioni di illuminazione dell'accettore per concentrarsi sulla superficie della diapositiva, identificabile come piano focale con il segnale più luminoso. Piccoli difetti nel rivestimento saranno visibili per aiutare a concentrarsi. Spostare la diapositiva in un'area con fluorescenza uniforme attraverso il piano di imaging.
Fare clic su Crea impostazione per la prima calibrazione o Impostazione aggiornamento per le calibrazioni successive. Il software inizializza il processo di calibrazione, sbiancando e rilevando automaticamente la posizione del punto sbiancato. Garantire una calibrazione riuscita valutando l'immagine finale, che sarà una griglia tre per tre di punti sbiancati che dovrebbero essere distribuiti in modo uniforme e a fuoco.
Salvare l'immagine di calibrazione per riferimento futuro. Rimuovere la diapositiva di calibrazione e archiviare in modo sicuro. La calibrazione deve essere eseguita prima di iniziare ogni esperimento, ma non deve essere eseguita tra i campioni.
Preparare la configurazione della microscopia per l'imaging a cellule vive, preferibilmente con uno stadio riscaldato e un obiettivo, nonché un controllo dell'anidride carbonica. Lasciare equilibrare per 20 minuti. Ora posiziona uno dei campioni generati di cellule che esprimono il sensore di tensione nel supporto del microscopio per l'imaging.
Lasciare equilibrare le cellule per 10 minuti. Per garantire la salute delle celle con immagini, mantenere la temperatura a 37 gradi Celsius nella camera di imaging. Utilizzare una pompa peristaltica per passare l'anidride carbonica umidificata del 5% sui campioni a 15 millilitri al minuto per mantenere il pH.
Aprite lo strumento Acquisizione multidimensionale o MDA e impostatelo con i parametri di imaging FRET, inclusi i diversi set di filtri. Salvare l'MDA nella cartella sperimentale con il nome MDA_FRET_date. Impostare un altro MDA con i parametri di imaging FRAP, inclusi i diversi set di filtri, le impostazioni timelapse e il Journal per pulsare il laser dopo l'acquisizione pre-candeggina.
Salvare l'MDA nella cartella sperimentale con il nome MDA_FRAP_date. Nella barra degli strumenti nella parte superiore dello schermo selezionare Diario, Avvia registrazione. Aprire la finestra MDA, caricare lo stato MDA_FRET_date e premere Acquisisci.
Quindi caricare lo stato MDA_FRAP_date e premere Acquisisci. Al termine dell'acquisizione, nella barra degli strumenti nella parte superiore dello schermo, selezionare Diario, Interrompi registrazione. Salvare questo diario nella cartella sperimentale con il nome di FRETFRAP_date aggiungerlo a una barra degli strumenti per un facile accesso.
Chiudere la finestra MDA. Spostarsi nel campione utilizzando l'acquisizione dell'immagine in Acquisisci, Acquisisci con un tempo di esposizione minimo e un filtro di densità neutro per identificare le celle di interesse. Impostare la messa a fuoco automatica continua passando a Dispositivi, Messa a fuoco.
Mettere a fuoco manualmente il campione fino a raggiungere il piano di imaging corretto. Fate clic su Imposta messa a fuoco continua (Set Continuous Focus) e attendete che il sistema si adatti. Una volta regolato il sistema, fare clic su Avvia messa a fuoco continua.
Quindi trova una cella che esprima il sensore di tensione con una chiara localizzazione in una struttura di interesse e aggancia un'immagine. Disegna una regione rettangolare di interesse, o ROI, per evidenziare dove sbiancare. Archiviare questa posizione del ROI.
Inizializza ora il FRETFRAP_date di registrazione, che inizierà l'acquisizione di immagini FRET, seguito dall'inizializzazione del timelapse FRAP. Ripeti questi passaggi fino a quando non vengono acquisiti da 10 a 15 set di immagini. Quindi analizzare i dati FRET-FRAP come descritto nel protocollo di testo.
Ecco i risultati rappresentativi per l'imaging FRET del sensore di tensione della vinculina, a seguito della segmentazione e del mascheramento per isolare le aderenze focali. La variazione turale del carico di vinculina può essere vista attraverso la cella. L'imaging e l'analisi FRAP possono essere influenzati dalla stabilità dell'adesione focale.
Un'adesione focale che si sta trasferendo rapidamente durante il periodo di imaging può essere difficile da tracciare con precisione. Spesso questo è indicato da una curva FRAP che contiene discontinuità e ininterpretabile. Per una vinculina di tipo selvatico, esiste una correlazione inversa tra carico proteico e tasso di turnover, che indica che la vinculina è stabilizzata con la forza.
L'introduzione di una mutazione nella vinculina per effettuare il suo legame con la talina si traduce in un'inversione della correlazione, indicando che la vinculina che non è in grado di legare la talina è destabilizzata dalla forza. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di preparare correttamente i campioni, assicurarsi che le celle esprimano il sensore a livelli endogeni e scegliere attentamente i parametri di imaging. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'immunofluorescenza, la misurazione della dinamica della scala cellulare o cellule impegnative con vari inibitori al fine di rispondere a domande aggiuntive come come la proteina di interesse interagisce con altri componenti subcellulari per coordinare la risposta alla forza.
