Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области механобиологии, такие как, как силы передаются и чувствуются внутри клеток, а также между клетками и их окружающей средой. Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет получить доступ к информации молекулярной шкалы о том, как белки реагируют на механические силы в родном контексте живой клетки. Хотя этот метод был применен специально для изучения фокусного адгезии белка винкулина, он также может быть применен к другим механически чувствительным белкам, таким как талин, кадерин или несприн.
Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как правильная настройка изображения трудна, но необходима для успеха анализа. Начните эту процедуру со стабильного выражения конструкции датчика напряжения в нужном типе ячейки, как описано в текстовом протоколе. Для приготовления субстратов для посева клеток приобретем четыре 35-миллиметровые стеклянные блюда.
Работая в капюшоне клеточной культуры, в 15 миллилитровой конической трубке, сделайте четыре миллилитра по 10 микрограмм на миллилитр фибронектина в стерильном фосфатно-буферном солевом растворе, или PBS. Аккуратно инвертировать трубку один раз, чтобы смешать и пусть решение сидеть в течение пяти минут в капюшоне культуры клеток. Затем пипетка один миллилитр фибронектина раствора на каждом стеклянном дном блюдо.
Оставьте раствор фибронектина на блюдах на один час при комнатной температуре или на ночь при четырех градусах по Цельсию. Затем аспирировать раствор фибронектина и промыть один раз с PBS. Оставьте один миллилитр PBS на блюда, пока клетки не будут готовы к посеву.
После подсчета клеток, семена 30000 клеток на каждом фибронектин покрытием стеклянное блюдо с соответствующим полным средством для окончательного объема 1,5 миллилитров. Разрешить клетки распространяться в течение четырех часов после посева. На два часа распространения, аспирировать рост средств массовой информации и промыть один раз с изображения средств массовой информации.
Оставьте 1,5 миллилитров средств визуализации. Разогреть микроскоп, как описано в текстовом протоколе перед началом калибровки. Для калибровки лазера FRAP сначала откройте окно конфигурации лазера.
Установите настройки освещения на соответствующие настройки освещения FRAP для лазерного воздействия на образец. Затем установите настройки освещения на настройки освещения, подходящие для визуализации только флюорофора. Выберите цель для калибровки при настройке системы Координат.
Uncheck Вручную щелкните точки калибровки и проверьте изображения дисплея во время калибровки. Установите время обитемого до 10 000 микросекунд, а количество импульсов до 100. Теперь поместите калибровочные слайды, сделанные из бромистого этидия, запечатанного между стеклянной горкой и крышкой скольжения, в этап адаптер с крышкой скольжения вниз.
Используйте настройки освещения принимаетелей, чтобы сосредоточиться на поверхности слайда, идентифицируемого как фокусная плоскость с самым ярким сигналом. Небольшие дефекты в покрытии будут видны, чтобы помочь в фокусировке. Переместим слайд в область с равномерной флуоресценцией по всей плоскости изображения.
Нажмите на настройку создания для первой калибровки или настройки обновления для последующей калибровки. Программное обеспечение будет инициализировать процесс калибровки, автоматически отбеливания и обнаружения положения обесцвеченной точки. Обеспечить успешную калибровку путем оценки окончательного изображения, которое будет три на три сетки отбеленных точек, которые должны быть равномерно распределены и в фокусе.
Сохраните калибровочное изображение для будущей ссылки. Удалите калибровку слайда и безопасно хранить. Калибровка должна быть выполнена перед началом каждого эксперимента, но не должна быть выполнена между образцами.
Подготовьте установку микроскопии для визуализации живых клеток, предпочтительно с нагретой стадией и целью, а также для контроля двуокиси углерода. Дайте эквилибрировать в течение 20 минут. Теперь поместите один из генерируемых образцов клеток, выражаюющих датчик напряжения, в держатель микроскопа для визуализации.
Дайте клеткам уравночные в течение 10 минут. Для обеспечения здоровья изображенных клеток, поддерживать температуру на 37 градусов по Цельсию в камере изображений. Используйте перистальтический насос, чтобы пройти увлажненной 5%углекислого газа над образцами на 15 миллилитров в минуту для поддержания рН.
Откройте инструмент Multi-Dimensional Acquisition, или MDA, и установите его с параметрами изображения FRET, включая различные наборы фильтров. Сохраните этот MDA в экспериментальный folder с именем MDA_FRET_date. Найте еще один MDA с параметрами изображения FRAP, включая различные наборы фильтров, настройки Timelapse и журнал для импульса лазера после приобретения перед отбеливанием.
Сохраните этот MDA в экспериментальный Folder с именем MDA_FRAP_date. В панели инструментов в верхней части экрана выберите journal, Start Recording. Откройте окно MDA, загрузите MDA_FRET_date и нажмите Acquire.
Затем загрузите MDA_FRAP_date и нажмите Acquire. В конце приобретения, в панели инструментов в верхней части экрана, выберите журнал, Stop Recording. Сохраните этот журнал в экспериментальном Folder с именем FRETFRAP_date добавить его в панель инструментов для легкого доступа.
Закройте окно MDA. Перейдите образец с помощью изображения приобретения под Acquire, Приобрести с минимальным временем экспозиции и нейтральной плотности фильтра для выявления ячеек, представляющих интерес. Установите непрерывный автофокус, переориентация на устройства, Фокус.
Вручную сосредоточьтесь на образце до достижения правильной плоскости изображения. Нажмите Установите непрерывный фокус и ждите, пока система отрегулируется. Как только система отрегулируется, нажмите Кнопку Непрерывное Фокусировка.
Затем найдите ячейку, выражаюю датчик напряжения с четкой локализацией структуры интереса и привязать изображение. Нарисуйте прямоугольную область интереса, или рентабельность инвестиций, чтобы подчеркнуть, где отбеливатель. Храните это местоположение рентабельности инвестиций.
Теперь инициализируйте FRETFRAP_date журнал, который начнет приобретение изображений FRET, а затем инициализацию таймлапса FRAP. Повторите эти шаги до тех пор, пока не будет получено от 10 до 15 наборов изображений. Затем проанализируйте данные FRET-FRAP, подробно описанные в текстовом протоколе.
Здесь показаны репрезентативные результаты для изображения ФРЕТ датчика натяжения винкулина, после сегментации и маскировки для изоляции фокусных спаек. Спациальные изменения винкулин нагрузки можно увидеть по всей клетке. На визуализацию и анализ FRAP может повлиять стабильность фокусной адгезии.
Фокусное деление, которое быстро транслокирует в период визуализации, может быть трудно точно отследить. Часто об этом свидетельствует кривая FRAP, которая содержит разрывы и в неинтерпретемой. Для винкулина дикого типа существует обратная корреляция между белковой нагрузкой и скоростью оборота, что указывает на то, что винкулин стабилизируется силой.
Введение мутации в винкулине для осуществления его связывания с талином приводит к развороту корреляции, указывая, что винкулин, который не в состоянии связать талин дестабилизируется силой. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы подготовить образцы должным образом, убедитесь, что клетки выражают датчик на эндогенных уровнях и тщательно выбирать параметры изображения. После этой процедуры, другие методы, такие как иммунофлуоресценция, измерение динамики клеточной шкалы или сложные клетки с различными ингибиторами могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как, как белок интереса взаимодействует с другими субклеточными компонентами для координации реакции на силу.
