この方法は、細胞内だけでなく、細胞とその環境の間で力がどのように伝達され、感知されるのかなど、メカノバイオロジーの分野における重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、タンパク質が生きている細胞のネイティブコンテキスト内の機械的な力にどのように反応するかに関する分子スケール情報へのアクセスを可能にすることです。この方法は、特に、ビンクリンの焦点接着タンパク質の研究に適用されているが、それはまた、タリン、カドヘリンやヌレスミンなどの他の機械的に敏感なタンパク質に適用することができます。
この方法の視覚的なデモンストレーションは、適切なイメージング設定は困難であるが、解析の成功のために必要であるため、重要です。テキストプロトコルで詳述されているように、目的のセルタイプにおけるテンションセンサ構成体の安定した発現からこの手順を開始します。細胞の播種のための基質を準備するために、4つの35ミリメートルガラス底の皿を取得する。
細胞培養フードで働く、15ミリリットルの円錐形の管で、滅菌リン酸緩衝生理食塩水、またはPBSで1ミリリットルフィブロネクチンあたり10マイクログラムの4ミリリットルを作る。チューブを1回軽く反転させて混合し、溶液を細胞培養フードに5分間置きます。その後、各ガラス底皿にフィブロネクチン溶液の1ミリリットルをピペット。
フィブロネクチン溶液を室温で1時間、摂氏4度で一晩皿に置いておきます。次にフィブロネクチン溶液を吸引し、PBSで一度リンスする。細胞が播種の準備ができるまで皿にPBSの1ミリリットルを残します。
細胞を数えた後、種子30,000細胞を各フィブロネクチンコーティングガラス皿に、最終体積1.5ミリリットルの適切な完全な培地を有する。播種後4時間細胞を広げます。2時間の広がりで、成長培地を吸引し、イメージングメディアで一度リンスする。
1.5ミリリットルのイメージングメディアを残します。キャリブレーションを開始する前に、テキストプロトコルに記載されているように、顕微鏡を温めておいてください。FRAP レーザーを調整するには、まずレーザー構成ウィンドウを開きます。
サンプルへのレーザー露出に適した FRAP イルミネーション設定に照度設定を設定します。次に、レソクザルフルオロフォアのみをイメージングする場合に適した照明設定に「照明」設定を設定します。[座標系設定]で、キャリブレーションする目的を選択します。
[手動でキャリブレーション ポイントをクリックする] をオフにし、[キャリブレーション時に画像を表示する] をオンにします。ドウェル時間を10,000マイクロ秒に、パルス数を100に設定します。次に、ガラススライドとカバースリップの間に密封されたエチジウム臭化物で作られたキャリブレーションスライドを、カバースリップ側を下にしてステージアダプタに配置します。
アクセクサ照明の設定を使用して、最も明るい信号を持つ焦点面として識別可能なスライドの表面に焦点を合わせます。コーティングの小さな欠陥は集中を助けるために目に見える。画像撮影平面を横切って、蛍光が均一な領域にスライドを移動します。
最初のキャリブレーションの設定を作成するか、以降のキャリブレーションの場合は[設定を更新]をクリックします。ソフトウェアは、自動的に漂白し、漂白点の位置を検出し、キャリブレーションプロセスを初期化します。均一に分布し、焦点を合わせる必要がある漂白ポイントの3つによって3つ星のグリッドとなる最終的な画像を評価することによって、キャリブレーションを成功させます。
今後の参照用にキャリブレーションイメージを保存します。キャリブレーションスライドを取り外し、安全に保管します。キャリブレーションは各実験を開始する前に実行する必要がありますが、サンプル間で実行する必要はありません。
ライブ細胞イメージング用の顕微鏡設定を準備し、好ましくは加熱された段階と目的、ならびに二酸化炭素制御を行う。20分間平衡化します。次に、細胞の生成サンプルの1つを、張力センサーを発現させるものを顕微鏡ホルダーに入れイメージングします。
セルを 10 分間平衡させます。画像化された細胞の健康を確保するために、画像の部屋の37°Cで温度を維持する。蠕動ポンプを使用して、pHを維持するために1分間に15ミリリットルでサンプル上に加湿された5%の二酸化炭素を通過させます。
多次元集録(MDA)ツールを開き、異なるフィルタセットを含むFRETイメージングパラメータで設定します。この MDA を、MDA_FRET_dateという名前で実験フォルダーに保存します。異なるフィルタセット、タイムラプス設定、および漂白前取得後にレーザーをパルスするジャーナルを含むFRAPイメージングパラメータを備えた別のMDAを設定します。
この MDA を、MDA_FRAP_dateという名前で実験フォルダーに保存します。画面上部のツールバーで、[ジャーナル]、[記録の開始] の順に選択します。MDA ウィンドウを開き、MDA_FRET_date状態をロードして[取得]を押します。
次に、MDA_FRAP_date状態をロードし、取得を押します。取得の最後に、画面上部のツールバーで[ジャーナル]、[記録の停止]を選択します。このジャーナルをFRETFRAP_dateの名前で実験フォルダに保存し、ツールバーに追加して簡単にアクセスできます。
MDA ウィンドウを閉じます。[取得、最小露出時間と中立密度フィルターで取得]の下の画像取得を使用してサンプルをナビゲートし、対象セルを識別します。デバイス、フォーカスに移動して、連続オートフォーカスを設定します。
正しいイメージング平面に到達するまで、サンプルに手動で焦点を合わせます。[継続的なフォーカスの設定] をクリックし、システムが調整されるまで待ちます。システムが調整されたら、[連続的な焦点を開始]をクリックします。
次に、関心のある構造に明確な局在化を有する張力センサを発現するセルを見つけ、画像をスナップします。対象の長方形の領域(ROI)を描画して、漂白する場所をハイライトします。この ROI の場所を保存します。
次に、FRET イメージの取得を開始し、続いて FRAP タイムラプスの初期化を開始する FRETFRAP_date ジャーナルを初期化します。10~15個の画像セットが取得されるまで、これらの手順を繰り返します。次に、テキストプロトコルで詳述されているように、FRET-FRAPデータを分析します。
ここに示されているビンクリン張力センサのFRETイメージングの代表的な結果は、焦点接着を分離するためのセグメンテーションおよびマスキングに続く。ビンクリン負荷の容量変化は、細胞全体に見ることができる。FRAPイメージングおよび分析は、焦点接着安定性の影響を受ける可能性があります。
撮像期間中に急激に転位する焦点接着は、正確に追跡することが困難な場合があります。多くの場合、これは不連続性を含む FRAP カーブによって示され、解釈不能です。野生型のビンクリンの場合、タンパク質負荷と回転率の間には逆相関があり、ビンクリンが力によって安定化されることを示す。
タリンへの結合を起させるビンクリンに変異を導入すると、その相関の逆転をもたらし、タリンに結合できないビンキュリンが力によって不安定化することを示す。この手順を試みる間、サンプルを適切に準備し、細胞が内因性レベルでセンサーを発現していることを確認し、イメージングパラメータを慎重に選択することを忘れないでください。この手順に従って、免疫蛍光、細胞スケールダイナミクスの測定、または様々な阻害剤を有する困難な細胞などの他の方法は、目的のタンパク質が他の細胞内成分とどのように相互作用するかなどの追加の質問に答えて力に対する応答を調整するために行うことができる。
