Esse método pode responder a perguntas-chave no campo da mecanobiologia, como como as forças são transmitidas e sentidas dentro das células, bem como entre as células e seu ambiente. A principal vantagem dessa técnica é que permite o acesso às informações em escala molecular sobre como as proteínas respondem às forças mecânicas dentro do contexto nativo da célula viva. Embora este método tenha sido aplicado especificamente ao estudo da proteína de adesão focal vinculina, ele também pode ser aplicado a outras proteínas mecanicamente sensíveis, como talina, cadherinas ou nesprina.
A demonstração visual deste método é crítica, pois a configuração adequada de imagens é difícil, mas necessária para o sucesso da análise. Inicie este procedimento com expressão estável do sensor de tensão construído no tipo celular desejado, conforme detalhado no protocolo de texto. Para preparar substratos para semeadura celular, adquira quatro pratos com fundo de vidro de 35 milímetros.
Trabalhando em uma capa de cultura celular, em um tubo cônico de 15 mililitros, fazem quatro mililitros de 10 microgramas por mililitro fibronectina em solução salina tamponada com fosfato estéril, ou PBS. Inverta suavemente o tubo uma vez para misturar e deixe a solução ficar por cinco minutos na capa de cultura celular. Em seguida, pipeta um mililitro de solução de fibronectina em cada prato com fundo de vidro.
Deixe a solução de fibronectina nos pratos por uma hora à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, aspire a solução de fibronectina e enxágue uma vez com PBS. Deixe um mililitro de PBS nos pratos até que as células estejam prontas para semeadura.
Depois de contar as células, sementes 30.000 células em cada prato de vidro revestido de fibronectina com a mídia completa apropriada para um volume final de 1,5 mililitros. Deixe as células se espalharem por quatro horas após a semeadura. Com duas horas de divulgação, aspire a mídia de crescimento e enxágue uma vez com mídia de imagem.
Deixe 1,5 mililitros da mídia de imagem. Aqueça o microscópio conforme descrito no protocolo de texto antes de iniciar a calibração. Para calibrar o laser FRAP, primeiro abra a janela de configuração a laser.
Ajuste a configuração de iluminação nas configurações de iluminação FRAP apropriadas para exposição a laser à amostra. Em seguida, defina a configuração de iluminação para as configurações de iluminação apropriadas para a imagem apenas do fluoróforo aceitor. Selecione o objetivo de calibrar na configuração do sistema coordenada.
Desmarcar clique manualmente nos pontos de calibração e verifique exibir imagens durante a calibração. Defina o tempo de Dwell para 10.000 microsegundos e o número de pulsos para 100. Agora coloque o slide de calibração, feito de brometo de ethidium selado entre um escorregador de vidro e um deslizamento de tampa, no adaptador de palco com o lado de deslizamento da tampa para baixo.
Use as configurações de iluminação aceitadora para se concentrar na superfície do slide, identificável como o plano focal com o sinal mais brilhante. Pequenos defeitos no revestimento serão visíveis para ajudar no foco. Mova o slide para uma área com fluorescência uniforme através do plano de imagem.
Clique em Criar Configuração para a primeira calibração ou configuração de atualização para calibrações subsequentes. O software inicializará o processo de calibração, branqueando automaticamente e detectando a posição do ponto branqueado. Garanta uma calibração bem sucedida avaliando a imagem final, que será uma grade de três por três pontos branqueados que devem ser distribuídos uniformemente e em foco.
Salve a imagem de calibração para referência futura. Remova o slide de calibração e armazene com segurança. A calibração deve ser realizada antes de iniciar cada experimento, mas não precisa ser realizada entre as amostras.
Prepare a configuração da microscopia para imagens de células vivas, de preferência com um estágio aquecido e objetivo, bem como um controle de dióxido de carbono. Deixe equilibrar por 20 minutos. Agora coloque uma das amostras geradas de células expressando o sensor de tensão no suporte do microscópio para imagem.
Deixe as células se equilibrarem por 10 minutos. Para garantir a saúde das células imagens, mantenha a temperatura a 37 graus Celsius na câmara de imagem. Use uma bomba peristáltica para passar dióxido de carbono umidificado de 5% sobre as amostras a 15 mililitros por minuto para manter o pH.
Abra a ferramenta Aquisição Multidimensional, ou MDA, e configure-a com parâmetros de imagem FRET, incluindo os diferentes conjuntos de filtros. Salve este MDA na Pasta Experimental com o nome de MDA_FRET_date. Configure outro MDA com os parâmetros de imagem FRAP, incluindo os diferentes conjuntos de filtros, as configurações timelapse e o Journal para pulsar o laser após a aquisição pré-alvejante.
Salve este MDA na Pasta Experimental com o nome de MDA_FRAP_date. Na barra de ferramentas na parte superior da tela, selecione Diário, Comece a gravar. Abra a janela MDA, carregue o MDA_FRET_date e pressione a Acquire.
Em seguida, carregue o MDA_FRAP_date estado e pressione Acquire. No final da aquisição, na barra de ferramentas na parte superior da tela, selecione Diário, Stop Recording. Salve este Diário na Pasta Experimental com o nome de FRETFRAP_date e adicione-o a uma barra de ferramentas para fácil acesso.
Feche a janela do MDA. Navegue pela amostra usando a aquisição de imagem em Acquire, Adquira com tempo mínimo de exposição e filtro de densidade neutra para identificar as células de interesse. Defina foco automático contínuo navegando para Dispositivos, Focus.
Concentre-se manualmente na amostra até chegar ao plano de imagem correto. Clique em Definir foco contínuo e aguarde que o sistema se ajuste. Uma vez que o sistema se ajuste, clique em Iniciar o Foco Contínuo.
Em seguida, encontre uma célula expressando o sensor de tensão com localização clara para uma estrutura de interesse e snap uma imagem. Desenhe uma região retangular de interesse, ou ROI, para destacar onde alvejar. Armazene essa localização do ROI.
Agora inicialize o FRETFRAP_date revista, que iniciará a aquisição de imagens FRET, seguida pela inicialização do timelapse FRAP. Repita estas etapas até que 10 a 15 conjuntos de imagens sejam adquiridos. Em seguida, analise os dados do FRET-FRAP conforme detalhado no protocolo de texto.
Aqui estão os resultados representativos para a imagem FRET do sensor de tensão vinculina, seguindo segmentação e mascaramento para isolar aderências focais. A variação espacial da carga de vinculina pode ser vista em toda a célula. A imagem e a análise frap podem ser afetadas pela estabilidade da adesão focal.
Uma adesão focal que está se translocando rapidamente durante o período de imagem pode ser difícil de rastrear com precisão. Muitas vezes isso é indicado por uma curva FRAP que contém descontinuidades e ininterpretáveis. Para uma vinculação do tipo selvagem, há uma correlação inversa entre carga proteica e taxa de rotatividade, indicando que a vinculina é estabilizada pela força.
A introdução de uma mutação na vinculação para efetuar sua vinculação à talina resulta em uma reversão da correlação, indicando que a vinculação que é incapaz de ligar talin é desestabilizada pela força. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de preparar as amostras corretamente, garantir que as células estejam expressando o sensor em níveis endógenos e escolher parâmetros de imagem cuidadosamente. Após esse procedimento, outros métodos como a imunofluorescência, a medição da dinâmica da escala celular ou as células desafiadoras com vários inibidores podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais como como a proteína de interesse interage com outros componentes subcelulares para coordenar a resposta à força.
