이 방법은 세포와 그들의 환경 사이뿐만 아니라 세포 내에서 힘이 전염되고 감지되는 방법과 같은 메카노생물학 분야의 주요 질문에 대답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질이 살아있는 세포의 네이티브 문맥 내부의 기계적 힘에 어떻게 반응하는지에 관한 분자 규모 정보에 대한 액세스를 허용한다는 것입니다. 이 방법은 초점 접착 단백질 빈쿨린을 연구하기 위해 특별히 적용되었지만 탈린, 카데린 또는 네스프린과 같은 다른 기계적으로 민감한 단백질에도 적용될 수 있습니다.
적절한 이미징 설정은 어렵지만 분석의 성공을 위해 필요하기 때문에 이 방법의 시각적 데모는 매우 중요합니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 원하는 셀 유형에서 장력 센서 구조의 안정적인 발현으로 이 절차를 시작합니다. 세포 시딩을 위해 기판을 준비하려면 35mm 유리 바닥 접시 4기를 획득하십시오.
세포 배양 후드에서 일하는 15 밀리리터 원내 튜브에서 멸균 인산염 완충식식염용액 또는 PBS에서 밀리리터 섬유네틴 당 10 마이크로그램의 4밀리리터를 만듭니다. 튜브를 한 번 부드럽게 반전하여 혼합하고 용액이 세포 배양 후드에 5 분 동안 앉게하십시오. 그런 다음 각 유리 바닥 접시에 섬유 네틴 용액의 1 밀리리터를 파이펫.
섬유네틴 용액을 실온에서 1시간 또는 하룻밤 동안 섭씨 4도에 둡니다. 그런 다음 섬유 네틴 용액을 흡인하고 PBS로 한 번 헹구세요. 세포가 파종 할 준비가 될 때까지 요리에 PBS의 1 밀리리터를 둡니다.
세포를 세고 후, 종자 30, 000 세포는 1.5 밀리리터의 최종 부피에 적합한 완전한 매체를 가진 각 fibronectin 코팅 유리 접시에. 세포가 시드 후 4시간 동안 퍼지도록 합니다. 확산의 두 시간에, 성장 미디어를 흡인하고 이미징 미디어와 한 번 헹요.
이미징 미디어의 1.5 밀리리터를 남겨주세요. 교정을 시작하기 전에 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 현미경을 예열합니다. FRAP 레이저를 보정하려면 먼저 레이저 구성 창을 엽니다.
샘플에 레이저 노출을 위한 적절한 FRAP 조명 설정으로 조명 설정을 설정합니다. 그런 다음 조명 설정을 수용자 형광소만 이미징에 적합한 조명 설정으로 설정합니다. 좌표 시스템 설정에서 보정할 목표를 선택합니다.
교정 지점을 수동으로 클릭하고 보정 중에 이미지 표시를 확인합니다. Dwell 시간을 10, 000 마이크로초로 설정하고 펄스 수를 100으로 설정합니다. 이제 유리 슬라이드와 커버 슬립 사이에 밀봉 된 에티듐 브로마이드로 만든 교정 슬라이드를 커버 슬립 사이드가있는 무대 어댑터에 놓습니다.
수용자 조명 설정을 사용하여 슬라이드 표면에 초점을 맞추고 가장 밝은 신호가 있는 초점 평면으로 식별할 수 있습니다. 코팅의 작은 결함은 초점을 돕기 위해 볼 수 있습니다. 슬라이드를 이미징 평면을 가로질러 균일한 형광이 있는 영역으로 이동합니다.
후속 교정을 위한 첫 번째 교정 또는 업데이트 설정에 대한 설정 만들기를 클릭합니다. 이 소프트웨어는 교정 프로세스를 초기화하여 표백된 점의 위치를 자동으로 표백하고 감지합니다. 최종 이미지를 평가하여 성공적인 교정을 보장하며, 이는 균일하게 분포되고 집중해야 하는 표백된 점의 3대 3 그리드가 됩니다.
향후 참조를 위해 교정 이미지를 저장합니다. 교정 슬라이드를 제거하고 안전하게 보관합니다. 교정은 각 실험을 시작하기 전에 수행해야하지만 샘플 간에 수행 할 필요가 없습니다.
살아있는 세포 화상 진찰을 위한 현미경 설정을 준비합니다, 바람직하게는 가열된 단계 및 객관적으로, 뿐만 아니라 이산화탄소 통제. 20분 동안 평형화합니다. 이제 장력 센서를 발현하는 세포의 생성 된 샘플 중 하나를 이미징을 위한 현미경 홀더에 배치하십시오.
세포가 10분 동안 평형화되도록 합니다. 이미지 된 세포의 건강을 보장하기 위해 이미징 챔버에서 섭씨 37도에서 온도를 유지합니다. 연동 펌프를 사용하여 분당 15 밀리리터의 시료위에 가습된 5%의 이산화탄소를 전달하여 pH를 유지합니다.
다차원 수집 또는 MDA 도구를 열고 다양한 필터 세트를 포함하여 FRET 이미징 매개 변수로 설정합니다. 이 MDA를 MDA_FRET_date 이름으로 실험 폴더에 저장합니다. 다양한 필터 세트, 타임랩스 설정 및 저널을 포함하여 FRAP 이미징 매개 변수를 사용하여 다른 MDA를 설정하여 표백제 전 획득 후 레이저를 펄스합니다.
이 MDA를 MDA_FRAP_date 이름으로 실험 폴더에 저장합니다. 화면 상단의 도구 모음에서 저널을 선택하고 녹음을 시작합니다. MDA 창을 열고 MDA_FRET_date 상태를 로드하고 획득을 누릅니다.
그런 다음 MDA_FRAP_date 상태를 로드하고 획득을 누릅니다. 수집이 끝나면 화면 상단의 도구 모음에서 저널을 선택하고 녹화를 중지합니다. 이 저널을 FRETFRAP_date 이름으로 실험 폴더에 저장하고 쉽게 액세스할 수 있도록 도구 모음에 추가합니다.
MDA 창을 닫습니다. 획득에서 이미지 수집을 사용하여 샘플을 탐색하고 노출 시간을 최소화하고 중립 밀도 필터를 획득하여 관심 있는 셀을 식별합니다. 장치, 초점으로 이동하여 연속 자동 초점을 설정합니다.
올바른 이미징 평면에 도달할 때까지 샘플을 수동으로 집중합니다. 연속 초점 집합을 클릭하고 시스템이 조정될 때까지 기다립니다. 시스템이 조정되면 연속 초점 시작을 클릭합니다.
그런 다음 관심 있는 구조에 명확한 국소화를 사용하여 장력 센서를 표현하는 셀을 찾아 이미지를 스냅합니다. 표백위치를 강조하기 위해 직사각형 관심 영역(ROI)을 그립니다. 이 ROI 위치를 저장합니다.
이제 FRET 이미지 의 수집을 시작하고 FRAP 타임랩스의 초기화가 시작되는 FRETFRAP_date 저널을 초기화합니다. 10~15개의 이미지 집합을 획득할 때까지 이러한 단계를 반복합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 FRET-FRAP 데이터를 분석합니다.
여기에 비쿨린 장력 센서의 FRET 이미징에 대한 대표적인 결과이며, 세분화 및 마스킹을 통해 초점 접착을 분리합니다. 빈쿨린 하중의 간격 적 변화는 셀 전체에서 볼 수 있습니다. FRAP 이미징 및 분석은 초점 접착 안정성에 의해 영향을 받을 수 있습니다.
이미징 기간 동안 빠르게 배분되는 초점 접착은 정확하게 추적하기가 어려울 수 있습니다. 종종 이것은 불연속성을 포함하고 해석할 수 없는 FRAP 곡선으로 표시됩니다. 야생 형 빈큘린의 경우, 단백질 부하와 이직률 사이에 는 비분별 상관 관계가 있으며, 이는 비카린이 힘에 의해 안정화되었음을 나타냅니다.
탈린에 대한 결합을 발휘하기 위해 빈쿨린에 돌연변이를 도입하면 상관 관계의 반전이 초래되며, 이는 탈신을 결합할 수 없는 빈분린이 힘에 의해 불안정하다는 것을 나타낸다. 이 절차를 시도하는 동안, 제대로 샘플을 준비하는 것을 기억하는 것이 중요합니다, 세포가 내인성 수준에서 센서를 표현하고 신중하게 이미징 매개 변수를 선택하는 것을 확인. 이 절차에 이어, 면역형광, 세포 규모 역학 측정 또는 다양한 억제제로 도전적인 세포와 같은 다른 방법은 관심의 단백질이 다른 아세포 구성 요소와 상호 작용하는 방법과 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있다.
