يمكن أن يساعد هذا الإجراء في الإجابة على الأسئلة الرئيسية. في مجال علم الإنسان. تلك الإجابة في وظيفة الضامة تحت نهاية الفسيولوجية للحالات المرضية.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن البولي إثيلينمين المغلفة يمكن بكفاءة في المختبر دون المساس الخلية. تحت الجرعات المثلى. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو العلاج والتشخيص للعديد من الاضطرابات الالتهابية المزمنة والسرطانات.
حيث الضامة تلعب دورا أساسيا في التسبب في الأمراض. إثبات الإجراء سيكون نا جيا. طالب دراسات عليا من مختبري
و (كايشوان وانغ) طالب دراسات عليا من مختبر الدكتور (شياو هوا) لإعداد حمض الحلفاء المعدل السوبر paramagnetic أكسيد الحديد الجسيمات النانوية أو SPION 'sاول إضافة 28 غراما من كلوريد الفراس الهكده. و 20 غراما pharas selfate heptahydrate إلى beaker تحتوي على 80 ملليلتر من المياه الأيونية.
واستخدم قناة زجاجية لإدخال النيتروجين في الحل. التحريك حتى يذوب المادة الصلبة. سخني خليط التفاعل إلى 72 درجة مئوية مع التحريك عند 800 دوران في الدقيقة.
وإضافة 40 ملليلتر من 28٪ من ماء الأمونيا إلى القارض. بعد خمس دقائق إضافة تسعة ملليلتر من حمض الحلفاء قطرة الحكمة. والحفاظ على الخليط في 72 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات مع اثارة مستمرة.
في نهاية الحضانة تبريد الحل الناتج عن درجة حرارة الغرفة. ويعجل الخليط عن طريق فصل المغناطيسي وفقا للبروتوكولات القياسية. ثم غسل SPION التي تحتوي على عجل ثلاث مرات مع الكحول الإيثيلي المطلق.
و asperse العجل في 100 ملليلتر من ن-هكسيان. لإعداد dimercapto حمض الاكريليك تعديل SPION إضافة 800 ملليغرام من حمض الحلفاء المعدلة SPION. مشتتة في 200 ملليلتر من ن-هكسيان و 400 ملليغرام من حمض الاكريليك dimercapto المنتشرة في 200 ملليلتر من الأسيتون في قارورة الرقبة الثلاث في حمام مائي في 60 درجة مئوية.
أضف المقبل 200 ميكرولترات من ثلاثية الإيثيلامين قطرة الحكمة إلى قارورة مع اثارة في تناوب 1000 في الدقيقة الواحدة و refluxing. ويمكن الحصول على عجل أسود عن طريق فصل المغناطيسي بعد خمس ساعات. ثم استخدام هيدروكسيد رباعي الميثيليوم لضبط درجة الH من الحل لتشتت متجانس من سبيون هيدروفيلي في المياه الأيونية.
البوليEthyleneimine المغلفة يبون إضافة حمض الاكريليك dimercapto تعديل حل SPION الغروية إسقاط الحكمة في حل البولي إثيلينمين 10 كيلودالون. في 500 ملليلتر ثلاث قارورة الرقبة تحت التحريك الميكانيكية في تناوب 1000 في الدقيقة لمدة ساعتين. في نهاية الحضانة إضافة الحل الناتج إلى أنبوب الترشيح فائقة مع قطع الوزن الجزيئية من 100 كيلودالتون ومحتوى 15 ملليلتر.
10- سترافوس العينة حتى يصل الحل المتبقي إلى حجم مليلتر واحد. إضافة المياه غير المؤينة إلى الحل لإعادة حجم إلى 15 ملليلتر. ووسترا وrhydse الحل عشر مرات أكثر كما أظهرت للتو.
ثم تصفية الحل من خلال مرشح 22 ميكرون للتخزين في أربع درجات مئوية. لإعداد جسيمات نانوية سيرنا أولا إضافة ثلاثة microliters من الطازجة 20 أعدت حلول siRNA micromolar إلى خمسة يسمى أنابيب الحمض النووي الريبي الحرة microcentroa التي تم تجهيزها. وإضافة 0، 8، 1.6، 3.2، و 6.4 ميكروغرام من البولي إثيلينمين SPION إلى أنابيب تحمل اسم صفر، واحد، اثنين، أربعة، وثمانية على التوالي.
بعد خلط مع الأنابيب لطيف، احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح للمجمعات البولي ايثيلينمين SPION سيرنا لتشكيل. و إعداد 3 في المئة agarose هلام مع أنا النقاء agarose. في نهاية الحضانة إضافة ميكرولتر واحد من 6X الحمض النووي تحميل العازلة لكل خمسة ميكرولترات من عينة لكل أنبوب ومزيج بعناية.
ثم تحميل كل من العينات على هلام. وتشغيل الكهرباء في خمسة فولت لكل سنتيمتر. حتى صبغة بروموفينول الزرقاء هجرة ثلثي الطول على الجل.
يوم واحد قبل transfection غسل الماوس microphage مثل RAW264.7 خلية ثقافة مع برنامج تلفزيوني. وعلاج الخلايا مع ملليلتر واحد من 25٪ التربسين لمدة خمس إلى عشر دقائق في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة خمسة في المئة. عندما تكون غالبية الخلايا قد انفصلت.
إلغاء تنشيط التربسين مع خمسة ملليلتر من DMEN كاملة. ثم pippete الحل عدة مرات لتفريق أي مجموعات الخلية. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب كوناكل معقمة 15 ملليلتر للطرد المركزي.
ثم قم بتعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من DMEN كاملة جديدة للعد. تخفيف الخلايا إلى 4.5 مرات عشرة إلى الخلايا الرابعة لكل ملليلتر من تركيز DMEN الكامل. وإضافة مليلترين من المتوسط إلى كل بئر من ستة بئر لمدة 24 ساعة حضانة في حاضنة ثقافة الخلية.
في اليوم التالي إعداد النسبة المناسبة من البولي ايثيلينمين SPION سيرنا النانوية في 1.5 ملليلتر RNA تيار microcentrifuge أنبوب مع خلط لطيف كما هو موضح للتو. وإضافة الحجم المناسب من البولي ايثيلينمين SPION SIION نانو جسيمات مجمع لكل بئر الذي تم استبداله مع ملليلتر واحد من المتوسطة الطازجة. إعداد البولي ايثيلينمين SPION si المجمعات.
في هذا المثال يمكن استخدام العديد من أشهر البولي ايثيلينمين سبون وبالتالي تقليل سميتها المحتملة. ثم دوامة لوحة بعناية لتحقيق توزيع متكافئ من الجسيمات النانوية عبر قيعان البئر. العودة لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية حتى التحديث الخلوية اللاحقة أو تحليل نقص الضربة القاضية الجينات.
Polyethyleneimine SPION مع قدرة زيتا 30.5 و 37 ملليفولت لا يحمل سمية cyto واضح في تركيزات تصل إلى 30 ميكروغرام من الحديد لكل ملليلتر. وهو حوالي استئجار أضعاف اثنين من التركيز المستخدم عادة لtransfefection الخلية. البولي ايثيلينمين سبون في إمكانات زيتا 48 millivolts ولكن سامة.
حتى في أقل جرعة فحصها. كما تم تحليلها بواسطة قياس الخلايا المتدفقة، يمكن أن تكون أكثر من 90٪ من الخلايا مصابة بالفلوري المسمى بوليثيلينمين SPION siRNA في مجمعات 15 ميكروغرام من الحديد لكل ملليلتر. تقييم آثار تركيزات البولي ايثيلينمين SPION سيرنا على استيعاب الخلايا عن طريق سحق تلطيخ الأزرق يكشف عن تلطيخ يمكن اكتشافه في 7.5 ميكروغرام من الحديد لكل ملليلتر.
ولكن البقع واضحة للعيان في 15 ميكروغرام من الحديد لكل ملليلتر التي لا تزيد في تركيزات أعلى من الحديد من المرجح أن يرجع إلى البولي ايثيلينمين SPION سيرنا امتصاص التشبع. الضامة البريتونية transphages مع البوليEthyleneimine SPION إيواء محددة siRNA المعرض انخفاضا كبيرا في مستويات مرنا targe مقارنة مع غير محددة سيرنا. مما يشير إلى أن سيرنا يمكن الهروب من vesicles endocytic في السيتوبلازم للوصول إلى آلية تدخل الحمض النووي الريبي.
كذلك بعد الحقن الوريدي من جرعة واحدة من البولي ايثيلينمين SPION siRNA مجمعات نانو جسيمات flocentimetrical تحليل الخلايا الإيجابية CD11b وD3 يكشف عن امتصاص أكثر كفاءة من الجسيمات النانوية من CD11b التعبير عن الضامة من الخلايا الإيجابية CD3 في أي وقت في جميع الأجهزة فحص. أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن تحضر البولي ايثيلينمين سبيون مع متوسط البيانات المحتملة لا يزيد عن 37 millivolts وإعداد مجمعات البولي ايثيلينمين SPION سيرنا على نسب منخفضة من الحديد إلى الـ سيرنا. هذه التقنية تقارن بين حاجة الباحثين لاستكشاف الإمكانات العلاجية لاستهداف الضامة في المحركات الحيوانية للمرض البشري مثل والسرطان.
