جيل من المهاجرين الزعترية المشتقة من iPSC من قبل ثقافة الجهاز الزعتري 3D هو الأول في طريقة vivo تجديد السكان متجانس من الخلايا التائية المستضد الورم محددة السذاجة. المزايا الرئيسية هي iTE هي أكثر ذات الصلة الفسيولوجية، وهذا الأسلوب أكثر قوة ثم أي أخرى في طريقة التفاضلية الجسم الحي لإنتاج خلايا T محددة باستمرار. iTE هو اضطراب متجانس من CD8 ألفا بيتا المضادة لجيني الخلايا التائية محددة مع الخلايا التائية ساذجة مثل النمط الظاهري وظيفية, بما في ذلك القدرة على الانتشار, remodiformation, وقمع الورم في الجسم الحي.
إثبات الإجراء سيكون الطبيب رفيق الإسلام بعد الدكتوراه في مختبري. لبدء ثقافة الخلايا OP9/DLL1 في وسائل الإعلام OP9 في 37 درجة مئوية. عندما تصل الخلايا إلى 80 إلى 95 في المئة التقاء، وغسلها مرة واحدة مع واحد X المغنيسيوم والكالسيوم والفينول الأحمر برنامج تلفزيوني مجانا.
إضافة أربعة ملليلتر من نقطة صفر خمسة في المئة التربسين واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم إضافة أربعة ملليلتر من وسائل الاعلام OP9 و pipet لفصل طبقة الخلية وجعل تعليق خلية واحدة. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر.
جهاز طرد مركزي عند 300 غ وبأربعون درجات مئوية لمدة خمس دقائق. التعرق والخلايا re-suspend في 12 ملليلتر من وسائل الإعلام OP9. ثم لوحة اثنين ملليلتر من تعليق خلية OP9/DLL1 في جديد 10 سم خلية ثقافة طبق بيتري.
إضافة ثمانية ملليلتر إضافية من الوسائط OP9. كرر هذا المقطع كل يومين إلى ثلاثة أيام. في اليوم صفر حصاد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات كما تعليق خلية واحدة عن طريق التربسينية.
جمع الخلايا والطرد المركزي في 300 G في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. استلهم البيرات وإعادة تعليق IPC في كثافة 100،000 خلية لكل 10 ملليلتر من وسائل الإعلام OP9. ثم لوحة 100، 000 الخلايا على التقاء OP9/DLL1 10 طبق سنتيمتر.
مواصلة الحضانة في 37 درجة مئوية مع خمسة في المئة من ثاني أكسيد الكربون. في اليوم الثالث تُطرّح وسائل الإعلام القديمة وتستبدلها بـ 10 ملليلترات من وسائل الإعلام OP9 الجديدة. في اليوم السادس يغسل كل 10 سم التقاء طبق OP9 مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.
إضافة ثلاثة ملليلتر من نقطة صفر خمسة في المئة التربسين إلى كل طبق. واحتضان لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة أربعة ملليلتر من وسائل الإعلام OP9 و pipet بلطف لجمع الخلايا.
تمرير الخلايا من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر والطرد المركزي في 300 G وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ثم تجاهل المُندفع. إعادة تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من وسائل الإعلام التمايز.
لوحة تعليق الخلية على جديد 10 سم OP9/DLL1 طبق التقاء. مواصلة الحضانة في 37 درجة مئوية مع خمسة في المئة من ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التاسع، تُطرّح وسائل الإعلام القديمة وتستبدلها بـ 10 ملليلترات من وسائل الإعلام المتمايزة الجديدة.
مواصلة احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية وخمسة في المئة CO2. في اليوم 11 عندما لوحظ cardiomyocytes في مستعمرات iPSC استخدام pipet لفصل ميكانيكيا الخلايا غير المنضمة. تصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر والطرد المركزي في 300 G وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
بعد هذا, pirate الماوس وإعادة تعليق الخلايا في 24 ملليلتر من وسائل الإعلام التمايز. لوحة iPSC في التقاء OP9/DLL1 ستة لوحة جيدا. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع خمسة في المئة من ثاني أكسيد الكربون.
في اليوم 15، وجمع جميع الخلايا غير المنضمة وتصفية لهم من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 40. جهاز طرد مركزي عند 300 غ وبأربعون درجات مئوية لمدة خمس دقائق. استمر في تمرير الخلايا غير المنضمة كل ثلاثة إلى أربعة أيام كما هو موضح مسبقًا.
في اليوم السابع من علاج DGWO ، أخرج أربعة أطباق جديدة طولها 10 سنتيمترات. ملء كل طبق مع 20 ملليلتر من وسائل الإعلام كاملة. نقل جميع الأغشية النيتروسليلوز مع الفصوص الزعتر في طبق واحد 10 سم.
باستخدام ملقط، فصل فصوص الفردية من الغشاء السماح لهم أن تكون مغمورة في وسائل الإعلام. احتضان الفصوص لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم نقل الفصوص الزعتر إلى طبق جديد 10 سم مع وسائل الإعلام كاملة.
واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. كرر هذا النقل وحضانة مرتين إضافيتين. باستخدام ملقط، إصلاح الفصوص الزعترية إلى الطبق أثناء استخدام اليد الأخرى لجعل شق عميق 100 إلى 200 ميكرومتر في المركز وتمديد نصف قطر الفص لتسهيل الهجرة إلى الخلية T السلف في الفص.
نقل الفصوص الزعتر إلى طبق جديد 10 سم مليئة وسائل الإعلام التمايز الكامل. إذا كان استخدام لوحات 3D ثقافة مع الشبكات المستوى السفلي والعلوي، وملء كل من الشبكات مع PPS عقيمة لمنع تبخر وتجفيف قطرات معلقة. نقل المقبل 30 microliters من وسائل الإعلام كاملة تحتوي على واحد DGWO تعامل الفص الزعتر في كل بئر من لوحة الثقافة 3D.
جمع خلايا نسب T غير المنضمة من الثقافة المشتركة OP9/DLL1. وإعادة تعليق الخلايا في كثافة من 2، 000 إلى 5، 000 T خلايا النسب خلية لكل 20 ميكرولترات من وسائل الإعلام. أضف 20 ميكرولترات من تعليق خلية النسب T إلى كل فص ثومي في لوحة الثقافة ثلاثية الأبعاد.
احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع خمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي، تعيين الأنابيب P200 إلى 30 ميكروليتر. Pipet وسائل الإعلام في كل بئر صعودا وهبوطا عدة مرات لإزالة جميع الخلايا المحيطة الفصوص الزعتر.
ثم تُشعّر وسائل الإعلام من كل بئر وتستبدلها بـ 30 ميكرولترات من وسائل الإعلام الكاملة. كرر هذه العملية، pipeting وإزالة واستبدال الوسائط خمس إلى سبع مرات لإزالة أي خلايا T غير ناضجة إضافية التي لا ترحيل إلى الفصوص. مواصلة احتضان الفصوص، والتأكد من تغيير 25 إلى 30 ميكرولترات من وسائل الإعلام يوميا.
في اليوم الرابع أو الخامس، استخدم المجهر الخفيف لتأكيد تشكيل هالة من المهاجرين الزعتريين المشتقين من iPSC حول الفصوص. جمع iTE يوميا عن طريق الأنابيب وسائل الإعلام دون انقطاع الفص. تغيير الوسائط كل يوم ومتابعة مجموعة تصل إلى ما يقرب من 12 يوما.
حصاد iTE جاهزة للاستخدام للتحليل الجزيئي أو في تجارب زرع الجسم الحي. في هذه الدراسة، يتم تقسيم الزعتس الجنينية المشتركة الثقافة لتحليل ما إذا كان يمكن لخلايا نسب الخلايا التائية المشتقة من iPSC أن تنتقل إلى الفصوص الزعترية. تحتوي الفصوص غير المصنفة على بنية أنسجة تتميز بشبكات ظهارية ظهارية تشبه الخلايا الفلكية المنتشرة من الخلايا الإيجابية CD3 الذاتية.
ومع ذلك يتم إعادة ملء الفصوص الزعتية بذر مع الخلايا التائية غير الناضجة المشتقة من iPSC مع خلايا CD3 أحادية النوى الإيجابية التي تشير إلى ترحيل الخلايا التائية غير الناضجة المشتقة من iPSC إلى الفصوص. الخلايا التائية التي تهاجر إلى، وتنضج، داخل البيئة الدقيقة الزعتية في وقت لاحق الخروج كما iTE. ثم يتم استخدام تحليل تدفق السيتومترية لاختبار توصيف فينوتبيك من الخلايا المختلفة.
الخلايا التائية الزعترية اضافية تظهر CD4, CD8 مزدوج إيجابية الخلايا T و CD8 ألفا الخلايا التائية إيجابية واحدة دون التعبير عن علامة اختيار إيجابية, MHC فئة واحدة في حين أن iTE هي سكان متجانسة من CD8 ألفا واحد إيجابي MHC فئة واحد إيجابية T الظاهري تشير إلى مرورهم الناجح من خلال اختيار إيجابي قبل الخروج من الفص الرثوم. ITE لها anti-specificity ضد cognate الببتيد. iTE شارك في تربية مع الخلايا المستضدية تقديم محملة مسبقة مع الببتيد غير ذي صلة كما لا تظهر النيوكليبروتين في إنتاج الخلوية من السيتوكينات.
ومع ذلك iTE مستضد شارك في تقديم الخلايا قبل نبض مع cognate الببتيد GP100، وإنتاج داخل الخلايا TNF ألفا interleukin الثاني وترفيرفيرون غاما. يرجى تذكر أن ثقافة خلية الخط المفتوح تعتمد بشدة على فتحة ABS. يمكن استخدام iTE المنشأة في أي مقاصة أخرى تعمل مع الخلايا التائية التقليدية.
على سبيل المثال، الخلية T مسح المقايسة، اختبار إنتاج السيتوكين، في التجارب الانحدار الورم الجسمية، T دراسة تمايز الخلية، وهلم جرا. ويمكن تطبيق هذه التكنولوجيا على العديد من المناعية أو مشروع من هذا القبيل. بما في ذلك تمايز الخلية T، نبض توقيت ت الخلية نضوج، وتوليد الخلية T المستضد محددة من ذرية الهماتوقراطية أو الخلايا الجذعية.
بعد مشاهدة هذا الفيديو يجب على المشاهد فهم كيفية توليد مستحثة متعددة القدرات، الجذعية المستمدة الخلية، مستضد الورم محددة المهاجرين الزعتر باستخدام نظام ثقافة الجهاز الزعتر 3D.
