La génération d’émigrants thymiques dérivés de l’iPSC par une culture d’organe thymique 3D est la première méthode in vivo régénérant la population homogène des cellules T naïves spécifiques à l’antigène tumoral. Les principaux avantages sont l’iTE sont plus physiologiquement pertinents, et cette méthode plus est plus puissant que toute autre méthode différentielle in vivo pour produire constamment une cellule T spécifique. l’iTE est le renversement homogène des cellules T spécifiques d’anti-genous alpha-bêta de CD8 avec un phénotype fonctionnel naïf de cellule T-comme, y compris la capacité de prolifération, de remodiformation, et de suppression de tumeur in vivo.
Démontrer la procédure sera le Docteur Rafiqul Islam un post-doc dans mon laboratoire. Pour commencer la culture OP9/DLL1 cellules dans les médias OP9 à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules atteignent 80 à 95 pour cent de confluence, lavez-les une fois avec un X magnésium, calcium, et phénol rouge PBS libre.
Ajouter quatre millilitres de point zéro cinq pour cent trypsine et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite quatre millilitres de supports op9 et de pipet pour dissocier la couche cellulaire et faire une suspension à cellule unique. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres à travers une passoire à cellules de 100 micromètres.
Centrifugeuse à 300 G et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Aspirez les cellules suppurées et suspendez à nouveau les cellules en 12 millilitres de supports OP9. Puis plaque deux millilitres de la suspension cellulaire OP9/DLL1 dans une nouvelle boîte de 10 centimètres de culture cellulaire Petri.
Ajoutez huit millilitres supplémentaires de supports OP9. Répétez ce passage tous les deux ou trois jours. Le jour zéro récolte les cellules souches pluripotentes induites comme une suspension cellulaire unique par trypsinisation.
Recueillir les cellules et la centrifugeuse à 300 G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Aspirez le supernatant et suspendez les CIP à une densité de 100 000 cellules par 10 millilitres de médias OP9. Ensuite, plaquez 100 000 cellules sur un plat confluent OP9/DLL1 de 10 centimètres.
Poursuivre l’incubation à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone. Le troisième jour aspirer les anciens médias et le remplacer par 10 millilitres de nouveaux médias OP9. Le sixième jour laver chaque plat OP9 confluent de 10 centimètres avec 10 millilitres de PBS.
Ajouter trois millilitres de trypsine point zéro cinq pour cent à chaque plat. Et incuber pendant trois à cinq minutes à température ambiante. Ajouter quatre millilitres de supports OP9 et pipet doucement pour recueillir les cellules.
Passez les cellules à travers une passoire et une centrifugeuse de cellules de 100 micromètres à 300 G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Puis jetez le surnatant. Suspendre à nouveau les cellules en 10 millilitres de médias de différenciation.
Plaquez la suspension cellulaire sur un nouveau plat confluent OP9/DLL1 de 10 centimètres. Poursuivre l’incubation à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone. Le neuvième jour, aspirez les vieux médias et remplacez-les par 10 millilitres de médias de différenciation frais.
Continuer à couver les cellules à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de CO2. Le jour 11, lorsque des cardiomyocytes sont observés dans les colonies d’iPSC, utilisez un pipet pour détacher mécaniquement les cellules non adhérentes. Filtrer les cellules à travers une passoire à cellules de 100 micromètres et centrifugeuse à 300 G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Après cela, aspirer le supernatant et re-suspendre les cellules en 24 millilitres de médias de différenciation. Plaquez l’iPSC dans une plaque de puits OP9/DLL1 confluente. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone.
Le jour 15, recueillir toutes les cellules non adhérentes et les filtrer à travers une passoire à cellules de 40 micromètres. Centrifugeuse à 300 G et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Continuer à passer les cellules non adhérentes tous les trois à quatre jours comme décrit précédemment.
Au septième jour du traitement DGWO, sortez quatre nouveaux plats de 10 centimètres. Remplissez chaque plat de 20 millilitres de supports complets. Transférer toutes les membranes de nitrocellulose avec des lobes thymiques dans un plat de 10 centimètres.
À l’aide de forceps, détachez les lobes individuels de la membrane, ce qui leur permet d’être immergés dans les médias. Incuber les lobes pendant une heure à température ambiante. Transférer ensuite les lobes thymiques dans un nouveau plat de 10 centimètres avec un média complet.
Et incuber pendant une heure à température ambiante. Répétez ce transfert et l’incubation deux fois de plus. À l’aide de forceps, fixer les lobes thymiques au plat tout en utilisant l’autre main pour faire une incision profonde de 100 à 200 micromètres au centre et étendre la moitié du diamètre du lobe pour faciliter la migration progénitrice des cellules T dans le lobe.
Transférer les lobes thymiques dans un nouveau plat de 10 centimètres rempli de supports de différenciation complets. Si vous utilisez des plaques de culture 3D avec des grilles de niveau inférieur et supérieur, remplissez les deux grilles de Stéril PPS pour éviter l’évaporation et le séchage des gouttes suspendues. Prochain transfert 30 microlitres de supports complets contenant un lobe thymique traité par DGWO dans chaque puits de la plaque de culture 3D.
Recueillir les cellules de lignée T non adhérentes de la co-culture OP9/DLL1. Et re-suspendre les cellules à une densité de 2000 à 5000 cellules T par 20 microlitres de médias. Ajouter 20 microlitres de la suspension cellulaire de lignée T à chaque lobe thymique dans la plaque de culture 3D.
Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone. Le lendemain, réglez le pipet P200 à 30 microlitres. Pipet le média dans chaque puits de haut en bas à plusieurs reprises pour enlever toutes les cellules entourant les lobes thymiques.
Ensuite, aspirez les médias de chaque puits et remplacez-les de 30 microlitres de supports complets. Répétez ce processus, pipeting, enlever, et le remplacement du média cinq à sept fois pour enlever toutes les cellules T immatures supplémentaires qui ne migrent pas dans les lobes. Continuez à couver les lobes, en vous assurant de changer 25 à 30 microlitres de médias par jour.
Le quatrième ou cinquième jour, utilisez une microscopie légère pour confirmer la formation d’un halo d’émigrants thymiques dérivés de l’iPSC autour des lobes. Recueillir le quotidien de l’iTE en pipeting médias sans perturbation du lobe. Changez les médias tous les jours et continuez la collecte jusqu’à environ 12 jours.
Les iTE récoltés sont prêts à être utilisés pour des expériences d’analyse moléculaire ou de transplantation in vivo. Dans cette étude, les thymus foetaux co-cultivés sont sectionnés pour analyser si les cellules de lignée de cellules T dérivées d’iPSC peuvent migrer dans les lobes thymiques. Les lobes de commande non ensemencés ont une architecture tissulaire caractérisée par un web épithélial thymique astrocyte-comme déployé des cellules positives endogènes de CD3.
Toutefois, les lobes thymiques ensemencés avec des lymphocytes T immatures dérivés de l’iPSC sont repeuplés avec des cellules mononucléaires positives CD3 indiquant la migration des lymphocytes T immatures dérivés de l’iPSC dans les lobes. Les cellules T qui migrent dans le microenvironnement thymique et mûrissent par la suite sous forme d’iTE. L’analyse cytométrique de flux est alors employée pour tester la caractérisation phénotypique de diverses cellules.
Les lymphocytes T thymiques supplémentaires présentent des lymphocytes T CD4, CD8 double positifs et des lymphocytes T positifs alpha cd8 alpha sans expression du marqueur de sélection positif, classe 1 du MHC, tandis que les iTE sont une population homogène de phénotype positif de cellules T MHC alpha unique de classe 1 cd8 indiquant leur passage réussi par sélection positive avant l’évacuation du lobe thymique. iTE ont l’antigène-spécificité contre le peptide cognate. iTE co-cultivé avec des cellules présentant des antigènes préchargés avec un peptide non pertinent que la nucléoprotéine ne montrent pas dans une production cellulaire de cytokines.
Cependant l’antigène de co-culture d’iTE présentant des cellules pré-pulsées avec le peptide cognate GP100, produisent intracellulairement TNF alpha interleukin ii et gamma d’interféron. S’il vous plaît rappelez-vous que la culture cellulaire en ligne ouverte est fortement dépendante de la fente ABS. ITE généré peut être utilisé dans n’importe quel autre essai de travail avec les cellules T conventionnelles.
Par exemple, l’analyse de compensation des lymphocytes T, l’analyse de production de cytokine, les essais de régression tumorale in vivo, l’étude de différenciation des lymphocytes T, et cetera. Cette technologie peut être appliquée à de nombreux projets immunologiques ou tels. Y compris une différenciation des cellules T, la maturation des cellules T par impulsions et la génération de cellules T spécifiques aux antigènes à partir d’un ancêtre hématocrit ou d’une cellule souche.
Après avoir regardé cette vidéo, le spectateur doit comprendre comment générer induit pluripotent, dérivé de cellules souches, émigrants thymiques spécifiques à l’antigène tumoral en utilisant un système de culture d’organes thymiques 3D.
