Поколение тимических эмигрантов, полученных iPSC, с помощью 3D-тимической культуры органов является первым методом in vivo, регенерирующим однородную популяцию опухолевых антиген-специфических наивных Т-клеток. Основными преимуществами являются iTE являются более физиологическими актуальными, и этот метод является более мощным, чем любой другой метод дифференциала in vivo для производства постоянно конкретных Т-клеток. iTE является однородным расстройство CD8 альфа-бета антигенных конкретных Т-клеток с наивным Т-клеток, как функциональный фенотип, в том числе способность к пролиферации, ремодиформации, и подавление опухоли in vivo.
Демонстрация процедуры будет доктор Рафикул Ислам пост-док в моей лаборатории. Для начала культуры OP9/DLL1 клетки в OP9 СМИ при 37 градусах по Цельсию. Когда клетки достигают 80 до 95 процентов слияния, мыть их один раз с одним X магния, кальция и фенола красный свободный PBS.
Добавить четыре миллилитров точки ноль пять процентов трипсина и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Затем добавьте четыре миллилитров средств массовой информации OP9 и пипетки, чтобы отмежеваться от клеточного слоя и сделать одноклеточную подвеску. Перенесите подвеску клетки в 50-миллилитровую коническую трубку через 100-метровый клеточный ситечко.
Центрифуга при 300 Г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Аспирировать суппурат и повторно приостановить клетки в 12 миллилитров OP9 средств массовой информации. Затем пластина два миллилитров OP9/DLL1 клеточной подвески в новый 10 сантиметров клеточной культуры Петри блюдо.
Добавьте еще восемь миллилитров средств массовой информации OP9. Повторите этот отрывок каждые два-три дня. На нулевом дне урожая индуцированные плюрипотентные стволовые клетки в качестве одноклеточной суспензии путем трипсинизации.
Соберите клетки и центрифугу при 300 Г при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Аспирировать супернатант и повторно приостановить IPC на плотность 100000 ячеек на 10 миллилитров OP9 средств массовой информации. Затем пластины 100000 клеток на слияние OP9/DLL1 10 сантиметров блюдо.
Продолжить инкубацию при 37 градусах по Цельсию с пятипроцентной двуокиси углерода. На третий день аспирировать старые средства массовой информации и заменить его на 10 миллилитров свежих средств массовой информации OP9. На шестой день мыть каждые 10 сантиметров confluent OP9 блюдо с 10 миллилитров PBS.
Добавить три миллилитров точки ноль пять процентов трипсина к каждому блюду. И инкубировать в течение трех-пяти минут при комнатной температуре. Добавьте четыре миллилитров средств массовой информации OP9 и аккуратно пипетки для сбора ячеек.
Пройдите клетки через 100-метровый клеточный ситечко и центрифугу при 300 Г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут. Затем отбросьте супернатант. Повторно приостанавливать клетки в 10 миллилитров дифференциации средств массовой информации.
Плита подвески клетки на новый 10 сантиметров OP9/DLL1 слияние блюдо. Продолжить инкубацию при 37 градусах по Цельсию с пятипроцентной двуокиси углерода. На девятый день, аспирировать старые средства массовой информации и заменить его на 10 миллилитров свежих средств дифференциации.
Продолжить инкубации клеток при 37 градусов по Цельсию и пять процентов CO2. На 11-й день, когда кардиомиоциты наблюдаются в колониях iPSC, используйте пипету для механического отсоединея неприлиптных клеток. Фильтровать клетки через 100-метровый клеточный ситечко и центрифугу при 300 G и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут.
После этого аспирировать супернатант и повторно приостановить клетки в 24 миллилитров дифференциации средств массовой информации. Плита iPSC в слияние OP9/DLL1 шесть пластины хорошо. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию с пяти процентов углекислого газа.
На 15-й день соберите все неприязаемые клетки и отфильтруйте их через 40-метровый клеточный ситечко. Центрифуга при 300 Г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Продолжайте проходить через неприятательные клетки каждые три-четыре дня, как описано ранее.
На седьмой день лечения DGWO, принять четыре новых 10 сантиметров блюд. Заполните каждое блюдо 20 миллилитров полных средств массовой информации. Перенесите все мембраны нитроцеллюлозы с тимическими долями в одно 10-сантиметровое блюдо.
Используя типсы, отсоедините отдельные доли от мембраны, позволяя им погружаться в средства массовой информации. Инкубировать доли в течение одного часа при комнатной температуре. Затем перенесите тимические доли в новое 10-сантиметровое блюдо с полными средствами массовой информации.
И инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре. Повторите эту передачу и инкубацию еще два раза. Используя типсы, исправить тимические доли к блюду при использовании другой стороны, чтобы сделать 100 до 200 микрометров глубокий разрез в центре и расширение половины диаметра доли для облегчения миграции Т-клеток прародителя в долей.
Перенесите тимические доли в новое 10-сантиметровое блюдо, наполненное полными средствами дифференциации. При использовании пластин 3D культуры с сетками нижнего и верхнего уровня, заполнить обе сетки стерильными PPS для предотвращения испарения и сушки висячих капель. Следующая передача 30 микролитров полных средств массовой информации, содержащих один DGWO лечение тимической доли в каждом колодец 3D пластины культуры.
Со-культуры OP9/DLL1 со-клетки линии T. И повторно приостановить клетки при плотности от 2000 до 5000 Т-клеток линии клеток на 20 микролитров средств массовой информации. Добавьте 20 микролитров подвески клеток линии T к каждой тимической доле в пластине 3D культуры.
Инкубировать ночь при 37 градусах по Цельсию с пятипроцентным углекислым газом. На следующий день установите трубу P200 до 30 микролитров. Pipet средств массовой информации в каждом хорошо вверх и вниз несколько раз, чтобы удалить все клетки, окружающие тимические доли.
Затем аспирировать средства массовой информации из каждой хорошо и заменить его 30 микролитров полного средства массовой информации. Повторите этот процесс, трубы, удаление, и замена средств массовой информации пять-семь раз, чтобы удалить любые дополнительные незрелые Т-клетки, которые не мигрируют в доли. Продолжить инкубации долей, убедившись, что изменить от 25 до 30 микролитров средств массовой информации в день.
На четвертый-пятый день используйте световую микроскопию, чтобы подтвердить образование ореола тимических эмигрантов, полученных iPSC, вокруг долей. Соберите iTE ежедневно путем трубопроводов средств массовой информации без нарушения доли. Меняем средства массовой информации каждый день и продолжаем сбор примерно до 12 дней.
Собранные iTE готовы к использованию для молекулярного анализа или экспериментов по трансплантации in vivo. В этом исследовании, совместно культурных фетальных тимусов разделиться для анализа ли iPSC производных Т-клеток линии клетки могут мигрировать в тимические доли. Un-seeded доли управления имеют архитектуру ткани, характеризующуюся астроцитов, как тимическая эпителиальная паутина развернуты эндогенных CD3 положительных клеток.
Однако тимические доли, посеянные с iPSC производных незрелых Т-клеток перенаселены CD3 положительные моноядерные клетки, указывающие на миграцию iPSC производных незрелых Т-клеток в доли. Т-клетки, которые мигрируют в, и зрелые, в рамках тимической микроокнимации впоследствии выход как iTE. Цитометрический анализ потока затем используется для проверки фенотипической характеристики различных клеток.
Дополнительные тимические Т-клетки показывают CD4, CD8 двойные положительные Т-клетки и CD8 альфа-одиночные положительные Т-клетки без выражения положительного маркера отбора, MHC Class One, в то время как iTE являются однородной популяцией CD8 альфа-одного положительного MHC Class One положительного фенотипа Т-клеток, указывающего на их успешный проход через положительный отбор до выхода из тимической доли. iTE имеют антиген-специфичность против пептида cognate. iTE совместно с антигеном, представляя клетки, предварительно загруженные с нерелевантным пептидом, как нуклеопротеин, не проявляются в клеточном производстве цитокинов.
Однако iTE со-культуры антигена представления клеток предварительно импульсных с cognate пептид GP100, производить внутриклеточно TNF альфа интерлеукин ii и интерферон гамма. Пожалуйста, помните, что культура открытых ячеев линии сильно зависит от слота ABS. Сгенерированный iTE может быть использован в любом другом анализе, работающем с обычными Т-ячейками.
Например, анализ Т-клеток, анализ производства цитокинов, регрессионные испытания опухоли in vivo, исследование дифференциации Т-клеток и так далее. Эта технология может быть применена ко многим иммунологическим или таким проектом. В том числе дифференциации Т-клеток, импульс времени созревания Т-клеток, и генерации антиген-специфических Т-клеток из гематокрита прародителя или стволовых клеток.
После просмотра этого видео зритель должен понять, как генерировать индуцированные плюрипотентные, стволовые клетки, полученные, опухолевый антиген специфических тимических эмигрантов с помощью 3D тимической системы культуры органов.
