通过3D胸腺器官培养产生由 iPSC 衍生的胸腺移民，是体内第一种再生肿瘤抗原特异性天真型T细胞同质种群的方法。主要优点是 iTE 更生理相关，而且这种方法比任何其他体内差分法更有效，能够不断产生特定的 T 细胞。iTE 是 CD8 alpha-beta 抗基因特异性 T 细胞的同质性，具有天真的 T 细胞样功能表型，包括体内增殖、再造和肿瘤抑制的能力。
演示这个程序将是拉菲库尔 · 伊斯兰医生在我的实验室博士后。在 37 摄氏度的 OP9 介质中开始培养 OP9/DLL1 细胞。当细胞达到80%至95%的汇合时，用一个X镁、钙和酚红色无维生素PBS洗一次。
加入四毫升点零百分之五的尝试，并在37摄氏度下孵育五分钟。然后添加四毫升的OP9介质和移液器，以解除细胞层的关联，并进行单个细胞悬浮。通过 100 微米细胞过滤器将悬浮液转移到 50 毫升锥形管中。
在300G和4摄氏度下离心5分钟。在OP9介质的12毫升中吸气和重新悬浮细胞。然后板两毫升的OP9/DLL1细胞悬浮成一个新的10厘米细胞培养培养皿。
添加另外八毫升的OP9介质。每两到三天重复一遍这段话。在零日收获诱导多能干细胞作为单细胞悬浮通过三位一体化。
在4摄氏度下收集细胞和离心机，在4摄氏度下进行5分钟。吸升液，以每10毫升OP9介质的密度重新悬浮 IPC。然后将10万个细胞板到汇合OP9/DLL1 10厘米的培养皿上。
在37摄氏度下继续孵育，二氧化碳含量为5%。第三天，对旧介质进行吸气，代之以 10 毫升的新鲜 OP9 介质。第六天，每10厘米清洗10厘米的相合OP9菜与10毫升的PBS。
在每个菜中加入三毫升点零百分之五的三点。并在室温下孵育三到五分钟。加入四毫升的OP9介质，轻轻移液收集细胞。
通过100微米细胞过滤器通过细胞，在300G和4摄氏度下离心5分钟。然后丢弃上一液。在10毫升的分化介质中重新悬浮细胞。
将细胞悬浮板到新的 10 厘米 OP9/DLL1 汇合盘中。在37摄氏度下继续孵育，二氧化碳含量为5%。第九天，吸进旧介质，代之以10毫升的新鲜分化介质。
继续在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育细胞。在第11天，当在 iPSC 菌落中观察到心肌细胞时，使用移液器机械地分离非粘附细胞。通过100微米细胞过滤器过滤细胞，在300G和4摄氏度下离心5分钟。
在此之后，吸升液，并在24毫升的分化介质中重新悬浮细胞。将 iPSC 板入汇合 OP9/DLL1 六井板。用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵育细胞。
第15天，收集所有非粘附细胞，并通过40微米细胞滤株过滤它们。在300 G和4摄氏度下离心5分钟。如前面所述，每三到四天继续传递一次非粘附细胞。
在DGWO治疗的第七天，拿出四个新的10厘米的盘子。用20毫升的完整介质填充每道菜。将所有带胸腺叶的硝基纤维素膜转移到一个10厘米的培养皿中。
使用钳子，将单个叶从膜上分离，使其浸入介质中。在室温下孵育叶一小时。然后将胸腺叶转移到一个新的10厘米的培养皿与完整的介质。
并在室温下孵育一小时。重复此转移和孵育两次。使用钳子，将胸腺叶固定到盘子上，同时用另一只手在中心进行 100 到 200 微米的深度切口，并延长叶的一半直径，以方便 T 细胞祖细胞迁移到叶中。
将胸腺叶转移到充满完全分化介质的新的 10 厘米培养皿中。如果使用带下部和上部栅格的 3D 培养板，请用灭菌 PPS 填充两个栅格，以防止悬挂滴的蒸发和干燥。接下来，将含有一个 DGWO 处理胸腺叶的完整介质的 30 微升转移到 3D 培养板的每个井中。
从 OP9/DLL1 共培养物中收集非粘附 T 血统细胞。每20微升培养的细胞密度为2000至5000T细胞系系细胞。在 3D 培养板的每个胸腺叶中加入 20 微升的 T 系系细胞悬浮液。
在37摄氏度下孵育过夜，二氧化碳含量为5%。第二天，将P200移液器设置为30微升。将每个井中的介质上下移数次，以去除胸腺叶周围的所有细胞。
然后从每个井中吸出介质，并更换 30 微升的完整介质。重复此过程，管道、移除和更换介质 5 到 7 次，以去除任何额外的未成熟 T 细胞，这些细胞不会迁移到叶中。继续孵育叶，确保每天更换25至30微升介质。
在第四天或第五天，使用光显微镜来确认叶周围由 iPSC 衍生的胸腺移民的光环的形成。通过管道介质收集 iTE 的每日数据，而不会造成叶中断。每天更换介质，并持续收集长达约 12 天。
收获的 iTE 可供用于分子分析或体内移植实验。在这项研究中，共培养的胎儿胸腺被分段，以分析 iPSC 衍生的T细胞系系细胞是否可以迁移到胸腺叶。未播种的控制叶具有组织结构，其特点是内源 CD3 阳性细胞部署的星细胞样胸腺上皮网。
然而，用 iPSC 衍生的未成熟 T 细胞种子的胸叶与 CD3 正单核细胞重新填充，表明 iPSC 衍生的未成熟 T 细胞迁移到叶中。在胸腺微环境内迁移到和成熟的T细胞随后作为TE出口。然后使用流细胞测量分析来测试各种细胞的表型表征。
额外的胸腺T细胞显示CD4，CD8双阳性T细胞和CD8阿尔法单阳性T细胞没有表达的阳性选择标记，MHC类1，而TE是CD8阿尔法单阳性MHC一级阳性MHC细胞型的同质群体，表明他们在从胸腺叶出口之前通过正选择的成功通过。iTe 对同源肽具有抗原特异性。iTE 与抗原共同培养，呈现与不相关的肽预加载的细胞，因为核蛋白不会显示成细胞因子的细胞生产。
然而，iTE共培养抗原呈现细胞预脉冲与同源肽GP100，产生细胞内TNFα白蛋白ii和干扰素伽马。请记住，开放线细胞培养强烈依赖于 ABS 插槽。生成的 iTE 可用于使用传统 T 细胞进行的其他检测。
例如，T细胞清除测定、细胞因子生产测定、体内肿瘤回归试验、T细胞分化研究等。这项技术可以应用于许多免疫学或此类项目。包括T细胞分化、脉冲定时T细胞成熟，以及造血干细胞或干细胞中抗原特异性T细胞。
观看此视频后，观看者应了解如何使用 3D 胸腺器官培养系统生成诱导多能、干细胞衍生、肿瘤抗原特异性胸腺移民。
