A geração de emigrantes timmicos derivados do iPSC por uma cultura de órgãos timímicos 3D é o primeiro método in vivo regenerando a população homogênea de células T específicas de antígeno tumoral. As principais vantagens são os iTE são mais fisiológicos relevantes, e esse método mais potente é mais potente do que qualquer outro método diferencial in vivo para produzir constantemente células T específicas. iTE é uma perturbação homogênea de células T específicas de cd8 alfa-beta com um fenótipo funcional ingênuo semelhante a células T, incluindo a capacidade de proliferação, remodiformação e supressão de tumor in vivo.
Demonstrando o procedimento será o Doutor Rafiqul Islam um pós-doutor no meu laboratório. Para começar a cultura células OP9/DLL1 em mídia OP9 a 37 graus Celsius. Quando as células atingirem 80 a 95% de confluência, lave-as uma vez com um X magnésio, cálcio e PBS livre de fenol.
Adicione quatro mililitros de ponto zero cinco por cento de trippsina e incubar a 37 graus celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione quatro mililitros de mídia OP9 e pipet para desassociar a camada celular e fazer uma única suspensão celular. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros através de um filtro de célula de 100 micrômetros.
Centrífuga a 300 G e a 4 graus Celsius por cinco minutos. Aspire o suppurate e suspenda as células em 12 mililitros de mídia OP9. Em seguida, a placa dois mililitros da suspensão celular OP9/DLL1 em uma nova placa petri cultura celular de 10 centímetros.
Adicione mais oito mililitros de mídia OP9. Repita esta passagem a cada dois ou três dias. No dia zero, as células-tronco pluripotentes induzidas como uma única suspensão celular por experimentação.
Colete as células e centrífugas a 300 G a 4 graus celsius por cinco minutos. Aspire o supernasce e suspenda os IPC a uma densidade de 100.000 células por 10 mililitros de mídia OP9. Em seguida, placa 100.000 células em um prato de 10 centímetros op9/DLL1 confluente.
Continue a incubação a 37 graus celsius com 5% de dióxido de carbono. No terceiro dia aspirar a mídia antiga e substituí-la por 10 mililitros de mídia OP9 fresca. No sexto dia lave cada prato OP9 confluente de 10 centímetros com 10 mililitros de PBS.
Adicione três mililitros de ponto zero cinco por cento de trippsina em cada prato. E incubar por três a cinco minutos em temperatura ambiente. Adicione quatro mililitros de mídia OP9 e tubos suavemente para coletar as células.
Passe as células através de um coador de células de 100 micrômetros e centrífuga a 300 G e quatro graus celsius por cinco minutos. Então descarte o supernaspeso. Suspenda as células em 10 mililitros de mídia de diferenciação.
Coloque a suspensão da célula em um novo prato confluente OP9/DLL1 de 10 centímetros. Continue a incubação a 37 graus celsius com 5% de dióxido de carbono. No nono dia, aspirar a mídia antiga e substituí-la por 10 mililitros de novos meios de diferenciação.
Continue incubando as células a 37 graus celsius e 5% de CO2. No dia 11, quando cardiomiócitos são observados em colônias iPSC usam uma tubulação para desprender mecanicamente células não aderentes. Filtre as células através de um coador de células de 100 micrômetros e centrífuga a 300 G e quatro graus celsius por cinco minutos.
Depois disso, aspire o supernasce e suspenda as células em 24 mililitros de mídia de diferenciação. Emplacar o iPSC em uma placa de seis poços OP9/DLL1 confluente. Incubar as células a 37 graus celsius com 5% de dióxido de carbono.
No dia 15, colete todas as células não aderentes e filtre-as através de um filtro de células de 40 micrômetros. Centrífuga a 300 G e a 4 graus celsius por cinco minutos. Continue a passar as células não aderentes a cada três ou quatro dias, como descrito anteriormente.
No sétimo dia de tratamento DGWO, tire quatro novos pratos de 10 centímetros. Encha cada prato com 20 mililitros de mídia completa. Transfira todas as membranas de nitrocelulose com lóbulos timológicos em um prato de 10 centímetros.
Usando fórceps, retire os lóbulos individuais da membrana permitindo que eles fiquem submersos na mídia. Incubar os lóbulos por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, transfira os lóbulos timímicos para um novo prato de 10 centímetros com mídia completa.
E incubar por uma hora em temperatura ambiente. Repita esta transferência e incubação mais duas vezes. Usando fórceps, fixar os lóbulos timímicos no prato enquanto usa a outra mão para fazer uma incisão profunda de 100 a 200 micrômetros no centro e estender metade do diâmetro do lobo para facilitar a migração progenitora de células T para o lobo.
Transfira os lóbulos timímicos para um novo prato de 10 centímetros cheio de mídia de diferenciação completa. Se usar placas de cultura 3D com grades de nível inferior e superior, encha ambas as grades com PPS estéreis para evitar a evaporação e secagem das gotas penduradas. Em seguida, transfira 30 microliters de mídia completa contendo um lobo timiário tratado DGWO em cada poço da placa de cultura 3D.
Colete as células de linhagem T não aderentes da co-cultura OP9/DLL1. E suspender as células a uma densidade de 2.000 a 5.000 células de linhagem celular T por 20 microliters de mídia. Adicione 20 microliters da suspensão da célula de linhagem T a cada lobo timímico na placa de cultura 3D.
Incubar durante a noite a 37 graus celsius com 50% de dióxido de carbono. No dia seguinte, defina a tubulação P200 para 30 microliters. Pipet a mídia em cada poço para cima e para baixo várias vezes para remover todas as células ao redor dos lóbulos timímicos.
Em seguida, aspire a mídia de cada poço e substitua-a de 30 microliters de mídia completa. Repita este processo, encostando, removendo e substituindo a mídia cinco a sete vezes para remover quaisquer células T imaturas extras que não migram para os lóbulos. Continue incubando os lóbulos, certificando-se de mudar de 25 a 30 microliters de mídia diariamente.
No quarto ou quinto dia, use microscopia leve para confirmar a formação de um halo de emigrantes timmicos derivados do iPSC ao redor dos lóbulos. Colete diariamente os meios de comunicação do ITE sem interrupções no lobo. Mude a mídia todos os dias e continue a coleta até aproximadamente 12 dias.
Os ITE's colhidos estão prontos para uso para análise molecular ou experimentos de transplante in vivo. Neste estudo, os timoes fetais co-cultivados são seccionados para analisar se as células de linhagem de células T derivadas do iPSC podem migrar para os lobos timiológicos. Os lóbulos de controle não semeados têm uma arquitetura tecidual caracterizada por uma teia epitelial semelhante a astrócito implantada de células positivas CD3 endógenas.
No entanto, os lobos timiços semeados com células T imaturas derivadas do iPSC são repovoados com células mononucleares positivas CD3 indicando migração de células T imaturas derivadas do iPSC para os lóbulos. Células T que migram para, e amadurecem, dentro do microambiente timiço posteriormente egresso como iTE. A análise citométrica de fluxo é então usada para testar a caracterização fenotípica de várias células.
Células T timic extra mostram CD4, CD8 células T duplamente positivas e células T alfa alfa single positivo sem expressão do marcador de seleção positivo, CLASSE 1 MHC enquanto iTE são uma população homogênea de CD8 alfa single positivo MHC Classe Um fenótipo de células T positivas indicando sua passagem bem sucedida através da seleção positiva antes da saída do lobo timiço. ITE tem antígeno-especificidade contra peptídeo cognato. iTE co-cultivado com células de apresentação de antígeno pré-carregados com um peptídeo irrelevante como nucleoproteína não mostram em uma produção celular de citocinas.
No entanto, o antígeno de co-cultura iTE apresentando células pré-pulsadas com peptídeo cognato GP100, produzem interleucina alfa intracelularmente II e interferon gama. Lembre-se que a cultura celular de linha aberta é fortemente dependente da ranhura ABS. O iTE gerado pode ser usado em qualquer outro ensaio que funcione com células T convencionais.
Por exemplo, ensaio de limpeza de células T, ensaio de produção de citocinas, ensaios de regressão de tumores in vivo, estudo de diferenciação de células T, etc. Essa tecnologia pode ser aplicada a muitos projetos imunológicos ou tais. Incluindo uma diferenciação de células T, maturação da célula T do tempo de pulso e a geração de células T específicas de antígeno a partir de progenitor hematócrito ou célula-tronco.
Depois de assistir a este vídeo, o espectador deve entender como gerar pluripotentes induzidos, células-tronco derivadas, emigrantes tímicos específicos do antígeno tumoral usando um sistema de cultura de órgãos timímicos 3D.
