La generazione di emigranti timici derivati dall'iPSC da parte di una coltura di organi timici 3D è il primo metodo in vivo che rigenera la popolazione omogenea di cellule T ingene specifiche dell'antigene tumorale. I principali vantaggi sono che l'iTE è più fisiologico rilevante e questo metodo è più potente di qualsiasi altro metodo differenziale in vivo per produrre costantemente una specifica cellule T. iTE è un turbamento omogeneo delle cellule T specifiche anti-genose CD8 alfa-beta con un fenotipo funzionale ingenuo simile a una cellula T, inclusa la capacità di proliferazione, rimodiformazione e soppressione del tumore in vivo.
A dimostrare la procedura sarà il dottor Rafiqul Islam un post-doc nel mio laboratorio. Per iniziare le impostazioni cultura delle celle OP9/DLL1 nei supporti OP9 a 37 gradi Celsius. Quando le cellule raggiungono l'80-95% di confluenza, lavarle una volta con un PBS privo di magnesio x, calcio e fenolo rosso.
Aggiungere quattro millilitri di punto zero cinque per cento di tripside e incubare a 37 gradi celsius per cinque minuti. Quindi aggiungere quattro millilitri di supporti OP9 e pipetta per dissociare lo strato cellulare ed effettuare una sospensione a cella singola. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 millilitri attraverso un filtro a celle da 100 micrometri.
Centrifuga a 300 G e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Aspirare il suppurato e sospendere di nuovo le cellule in 12 millilitri di supporti OP9. Quindi placcare due millilitri della sospensione cellulare OP9/DLL1 in una nuova piastra di Petri di coltura cellulare di 10 centimetri.
Aggiungere altri otto millilitri di supporti OP9. Ripeti questo passaggio ogni due o tre giorni. Il giorno zero raccolgono le cellule staminali pluripotenti indotte come sospensione a singola cellula per tripsidenza.
Raccogliere le cellule e la centrifuga a 300 G a quattro gradi celsius per cinque minuti. Aspirare il supernatante e sospendere di nuovo gli IPC ad una densità di 100.000 celle per 10 millilitri di supporti OP9. Quindi placcare 100.000 celle su un piatto confluente OP9/DLL1 da 10 centimetri.
Continuare l'incubazione a 37 gradi Celsius con il cinque per cento di anidride carbonica. Il terzo giorno aspirano i vecchi supporti e lo sostituiscono con 10 millilitri di supporti OP9 freschi. Il sesto giorno lavare ogni piatto OP9 confluente di 10 centimetri con 10 millilitri di PBS.
Aggiungere tre millilitri di punto zero cinque per cento di tripina ad ogni piatto. E incubare per tre o cinque minuti a temperatura ambiente. Aggiungere quattro millilitri di supporti OP9 e pipettare delicatamente per raccogliere le cellule.
Passare le cellule attraverso un colino a celle da 100 micrometri e centrifugare a 300 G e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi scartare il supernatante. Sospendere di nuovo le cellule in 10 millilitri di mezzi di differenziazione.
Placcare la sospensione cellulare su un nuovo piatto confluente OP9/DLL1 da 10 centimetri. Continuare l'incubazione a 37 gradi celsius con il cinque per cento di anidride carbonica. Il primo giorno, aspira i vecchi media e sostituiscilo con 10 millilitri di nuovi mezzi di differenziazione.
Continuare a incubare le cellule a 37 gradi celsius e al 5% di CO2. Il giorno 11, quando i cardiomiociti sono osservati nelle colonie iPSC, utilizzare una pipetta per staccare meccanicamente le cellule non aderenti. Filtrare le cellule attraverso un colino a celle da 100 micrometri e centrifugare a 300 G e quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Successivamente, aspirare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in 24 millilitri di mezzi di differenziazione. Placcare gli iPSC in una piastra di pozzo OP9/DLL1 confluente. Incubare le cellule a 37 gradi celsius con il cinque per cento di anidride carbonica.
Il giorno 15, raccogliere tutte le cellule non aderenti e filtrarle attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri. Centrifuga a 300 G e a quattro gradi celsius per cinque minuti. Continuare a migliorare le cellule non aderenti ogni tre o quattro giorni come descritto in precedenza.
Il settimo giorno di trattamento DGWO, esegui quattro nuovi piatti da 10 centimetri. Riempire ogni piatto con 20 millilitri di supporti completi. Trasferire tutte le membrane di nitrocellulosa con lobi timici in un piatto di 10 centimetri.
Usando le forcep, staccare i singoli lobi dalla membrana Permettendo loro di essere immersi nei media. Incubare i lobi per un'ora a temperatura ambiente. Quindi trasferire i lobi timici in un nuovo piatto di 10 centimetri con mezzi completi.
E incubare per un'ora a temperatura ambiente. Ripetere questo trasferimento e incubazione altre due volte. Usando le forcep, fissare i lobi timici al piatto mentre si utilizza l'altra mano per fare un'incisione profonda da 100 a 200 micrometri al centro ed estendendo metà del diametro del lobo per facilitare la migrazione del progenitore della cellula T nel lobo.
Trasferire i lobi timici in un nuovo piatto di 10 centimetri riempito con mezzi di differenziazione completi. Se si utilizzano piastre di coltura 3D con griglie di livello inferiore e superiore, riempire entrambe le griglie con PPS steril per evitare l'evaporazione e l'asciugatura delle gocce appese. Trasferire successivamente 30 microlitri di supporti completi contenenti un lobo timomico trattato da DGWO in ogni pozzo della piastra di coltura 3D.
Raccogliere le celle di derivazione T non aderenti dalle co-impostazioni cultura OP9/DLL1. E sospendere di nuovo le cellule ad una densità da 2.000 a 5.000 cellule T per 20 microlitri di media. Aggiungere 20 microlitri della sospensione cellulare del lignaggio T a ogni lobo timo nella piastra di coltura 3D.
Incubare durante la notte a 37 gradi celsius con anidride carbonica del cinque per cento. Il giorno dopo, impostare la pipetta P200 su 30 microlitri. Pipettare il supporto in ogni pozzo su e giù più volte per rimuovere tutte le cellule che circondano i lobi timici.
Quindi aspirare il supporto da ogni pozzo e sostituirlo con 30 microlitri di supporti completi. Ripetere questo processo, pipettando, rimuovendo e sostituendo il supporto da cinque a sette volte per rimuovere eventuali cellule T immature aggiuntive che non migrano nei lobi. Continuare a incubare i lobi, assicurandosi di cambiare da 25 a 30 microlitri di media ogni giorno.
Il quarto o quinto giorno, utilizzare la microscopia ottica per confermare la formazione di un alone di emigranti timici derivati dall'iPSC intorno ai lobi. Raccogli quotidianamente l'iTE tubazionando i supporti senza interruzioni del lobo. Cambia i supporti ogni giorno e continua la raccolta fino a circa 12 giorni.
Gli iTE raccolti sono pronti per l'uso per analisi molecolari o esperimenti di trapianto in vivo. In questo studio, i timo fetali co-coltivati vengono sessati per analizzare se le cellule di lignaggio delle cellule T derivate da iPSC possono migrare nei lobi timici. I lobi di controllo non seeded hanno un'architettura tissutale caratterizzata da una rete epiteliale timica simile ad un astrocita distribuita di cellule positive CD3 endogene.
Tuttavia i lobi timici seminati con cellule T immature derivate da iPSC sono ripopolati con cellule mononucleari positive CD3 che indicano la migrazione delle cellule T immature derivate dall'IPSC nei lobi. Le cellule T che migrano e maturano all'interno del microambiente timomico successivamente esgredano come iTE. L'analisi citometrica del flusso viene quindi utilizzata per testare la caratterizzazione fenotipico di varie cellule.
Le cellule T extra timemiche mostrano cellule T cd4, CD8 a doppia positività e cellule T positive CD8 alpha single senza espressione del marcatore di selezione positivo, classe MHC One mentre iTE sono una popolazione omogenea di fenotipo positivo della cellula MHC Class One positivo CD8 alpha che indica il loro passaggio positivo attraverso la selezione positiva prima dell'uscita dal lobo timico. iTE hanno una specificità antigene contro il peptide imparentato. iTE co-coltivato con antigene che presenta cellule precaricate con un peptide irrilevante come nucleoproteina non mostrano in una produzione cellulare di citochine.
Tuttavia l'antigene di co-coltura iTE che presenta cellule pre-pulsate con peptide imparentato GP100, produce intracellularmente TNF alfa interleuchina ii e gamma di interferone. Si prega di ricordare che la coltura cellulare a linea aperta dipende fortemente dallo slot ABS. L'iTE generato può essere utilizzato in qualsiasi altro saggio che lavora con celle T convenzionali.
Ad esempio, test di compensazione delle cellule T, saggio di produzione di citochine, studi di regressione tumorale in vivo, studio di differenziazione cellulare T, eccetera. Questa tecnologia può essere applicata a molti progetti immunologici o di questo tipo. Compresa una differenziazione delle cellule T, la maturazione delle cellule T di temporizzazione degli impulsi e la generazione di cellule T specifiche dell'antigene da progenitore ematocrito o cellula staminali.
Dopo aver visto questo video lo spettatore dovrebbe capire come generare emigranti timici specifici dell'antigene tumorale indotta, derivati da cellule staminali, utilizzando un sistema di coltura di organi timici 3D.
