يوفر تحويل الصور طريقة قابلة للتتبع في الجسم الحي للتحليل الكمي لخارج الكريات البيض للحصول على رؤية ميكانيكية في الإقامة في الكريات البيض وديناميات الخروج من مواقع الأنسجة المتعددة في الدول المريضة. حسناً، هنا نُظهر فائدة تتبع الكريات البيض من الأورام الجلدية. تطبيق هذا الفحص على الأنسجة والأمراض الأخرى محدودة فقط من خلال القدرة على إعطاء الضوء.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أن يسمح القياس الكمي من السكان الذاتية، بدلا من نقل الخلايا المناعية كما الخروج من الأنسجة الملتهبة في الجسم الحي. للحث على التهاب، بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القارص، استخدم ميكروبيجيت لإدارة 20 ميكرولترات من الفثالات ثنائي بوتيل أو DBP، إلى الجانب البطني من بين الأذن من فأر Kaede المعدلة وراثيا تخدير. بعد السماح للDBP لتجف، سحب الأذن من خلال شق في قطعة من رقائق الألومنيوم واستخدام الشريط على الوجهين لتأمين الأذن بشكل قاطع إلى احباط مع الجانب الظهري التي تواجه التصاعدي.
ثم، ضع أنك تحت مصدر ضوء نانومتر 405 وفوتكونفوتور لمدة ثلاث دقائق عند 100 مللي واط من الطاقة. للعدوى vaccinia، استخدم micropipette لإدارة 5 مرات 10 إلى وحدات تشكيل البلاك 6 من فيروس vaccinia في 10 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني على بينا الأذن من فأر Kaede المعدلة تخدير وكزة pinna 25 مرات. بعد 24 ساعة، photoconvert بينا كما أظهرت للتو.
عند نقطة الوقت التجريبي المناسبة، حصاد ال بينهاي والعقد الليمفاوية العنقية والأربية واستخدام اثنين من أزواج من ملاقط لتقشر بعيدا الجانب البطني والدوسل من كل بينا. ثم ضع العقد الليمفاوية وقطع الزنى ، مع مواجهة داخل الأذن لأسفل ، في آبار فردية من لوحة 24 بئرًا تحتوي على 1 ملليغرام لكل ملليلتر من Collagenase D و 80 وحدة لكل ملليلتر من Dnase مخففة في HBSS تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم. استخدام اثنين من الإبر قياس 29 ندف فتح كل كبسولة العقدة الليمفاوية ووضع لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
في نهاية الحضانة ، اضغط على الأنسجة المنهضوية والعقدة الليمفاوية من خلال 70 ميكرون مصافي خلايا النايلون منفصلة للحصول على تعليق خلية واحدة من كل الأنسجة. عندما نمت الأورام إلى الحجم التجريبي المناسب ، حلق أي فرو جديد حول موقع الورم وسحب الورم من خلال ثقب دائري قطع في قطعة من رقائق الألومنيوم. ضع الورم مباشرة تحت مصدر ضوء 405 نانومتر وفوتكونفوتور لمدة 5 دقائق عند 200 مللي واط من الطاقة.
بعد 24 ساعة من التحول الضوئي، حصاد الأورام والغدد العضدي والغدد الليمفاوية الإربية من كل واستخدام مقص ل mince الأورام داخل الآبار الفردية من لوحة 24-well التي تحتوي على كولاجيناز D وDNase في HBSS. ضع العقد الليمفاوية في آبار منفصلة وندف فتح كبسولات كما أظهرت للتو. بعد احتضان الأورام لمدة ساعة واحدة والغدد الليمفاوية لمدة نصف ساعة في 37 درجة مئوية ، اضغط على الأنسجة المهضومة من خلال مصافي منفصلة 70 ميكرون للحصول على تعليق خلية واحدة من كل نسيج.
لتحليل تعليق الخلايا المفردة عن طريق قياس الخلايا المتدفقة ، قم أولاً بجمع الطحال أو الدم من فأر معدل وراثيا Kaede وتحلل خلايا الدم الحمراء مع عازلة البوتاسيوم كلوريد الأمونيوم. تقسيم الخلايا إلى واحد Kaede FITC غير المحولة واحد Kaede PE السكان و resuspend لون واحد Kaede PE الخلايا في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني في بئر واحدة من لوحة 24 جيدا، ثم photoconvert الخلايا لمدة 5 دقائق تحت 405 نانومتر ضوء مصدر في 100 مللي واط من الطاقة. بعد ذلك استخدام الخلايا KAede PE المحولة ضوئيًا وخلايا Kaede FITC غير المحولة لضبط الفولتية المُتعدد الضوئي إلى 70 إلى 80٪ من النطاق الإجمالي لكل قناة فلورية.
مرة واحدة تم تعيين الفولتية لبروتينات كايدي، تعويض عن جميع البقع الأجسام المضادة الأولية الأخرى باستخدام حبات تعويض الفلوروور واحد المسمى، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم، تشغيل العينات على مقياس التدفق الكيسي وفقا لبروتوكولات التحليل السيتوميتري تدفق القياسية. تكشف عمليات التعليق الأحادية الخلية التي يتم إنشاؤها من جلد الأذن أو عنق الرحم الذي يستنزف العقد الليمفاوية مباشرة بعد التعرض للفوتونلوكونر عن كفاءة تحويل 78٪ لجميع الكريات البيض الإيجابية CD45 في الجلد ، مع عدم وجود خلايا محولة لوحظت في الغدد الليمفاوية المستنزفة.
ويكشف القياس الكمي لأعداد الكريات البيض الإيجابية CD45 المتسللة في الأذنين المقلوبتين صفرًا و24 ساعة بعد التحويل، أن التعرض للضوء البنفسجي يسبب زيادة ملحوظة إحصائيًا في تسلل الكريات البيض. هذه الزيادة في CD45 تسرب الكريات البيض إيجابية ومع ذلك، صغيرة بالنسبة للتسلل الناجم عن حافز التهابي قوي مثل فيروس التشنج. كما يزيد تحويل الصور من نفاذية الأوعية الدموية في الأذن المقيسة بمقاسات الأميال، مما يشير معًا إلى أنه يجب النظر في آثار الضوء البنفسجي على التهاب الأنسجة عند تحسين الجرعة ووقت التعرض وتفسير البيانات.
تحليل تدفق الخلايا الحرارية للخلايا السرطانية المفككة من الحيوانات المقلوبة ضوئيا يكشف عن تحويل كبير من الخلايا الإيجابية داخل الجسم CD45 من كايدي FITC إيجابية إلى كايدي PE إيجابية, في حين استنزاف الخلايا الليمفاوية العقدة لا تزال غير المحولة. اختلفت كفاءة تحويل الصور من الكريات البيض إيجابية CD45 بشكل كبير بين أنواع الأورام والأحجام، مع CD45 الكريات البيض الإيجابية داخل أورام سرطان الجلد الصغيرة مما يدل على التحول الضوئي الأكثر كفاءة. كما يزيد حجم الورم, انخفاض كفاءة التحويل إلى حوالي 50٪ لا سيما, الميلانين له تأثير لافت على كفاءة التحول الضوئي مع أقصى تحويل ضوئي للخلايا إيجابية CD45 لوحظ داخل الأورام المنتجة للميلانين من حوالي 30٪ فقط في الأورام الصغيرة, أن ينخفض إلى 10٪ كما أحجام الورم الاقتراب 400 ملليمتر مكعب.
فحص الورم استنزاف الغدد الليمفاوية 24 ساعة بعد photoconversion يكشف عن وجود خلايا المناعة الإيجابية الحمراء Kaede من مختلف الأنماط الظاهرية، مما يدل على الهجرة الكريات البيض من الورم photoconverted. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم المناعة للكشف عن حركية الحالة الثابتة ودوران الكريات البيض الملتهبة في الأنسجة الطرفية. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم التأكد من أن الأنسجة ذات الاهتمام فقط هو تحويل فوتونون، كما أن تحويل ضوئي غير مقصود من الأنسجة المحيطة بها سوف يعرض النتائج للخطر.
وينبغي أن الأفراد الجدد لهذه الطريقة تحسين وقت التعرض لتحويل الأنسجة الخاصة بهم، فضلا عن مدة من الأوقات قبل جمع الأنسجة يحدث على أساس ديناميات الكريات البيض من الفائدة.
