Photoconversion bietet eine nachvollziehbare In-vivo-Methode für die quantitative Analyse von Leukozyten-Egress für einen mechanistischen Einblick in Leukozyten-Residenz und Exit-Dynamik von mehreren Gewebestandorten in krankheitskranken Zuständen. Nun, hier zeigen wir den Nutzen der Leukozytenverfolgung von Hauttumoren. Die Anwendung dieses Assays auf andere Gewebe und Krankheiten ist nur durch die Fähigkeit zur Verabreichung von Licht begrenzt.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, die Quantifizierung endogener statt übertragener Immunzellpopulationen als Folge von entzündeten Geweben in vivo zu ermöglichen. Um Entzündungen zu induzieren, nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifung, verwenden Sie eine Mikropipette, um 20 Mikroliter Dibutylphthalat oder DBP zu verabreichen, auf die ventrale Seite der Ohrpinna einer anästhesierten Kaede transgene Maus. Nachdem Sie das DBP trocknen lassen, ziehen Sie das Ohr durch einen Schlitz in einem Stück Aluminiumfolie und verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um das Ohr flach an der Folie mit der dorsalen Seite nach oben zu befestigen.
Positionieren Sie dann, dass Sie sich direkt unter einer 405 Nanometer Lichtquelle befinden, und fotokonvertieren für drei Minuten bei 100 Milliwatt Leistung. Bei einer Impfung verwenden Sie eine Mikropipette, um 5 mal 10 bis zur 6. Plaque bildenden Einheiten des Impfvirus in 10 Mikroliter PBS auf die Ohrpinna einer anästhesierten Kaede transgene Maus zu verabreichen und die Pinna 25 Mal zu stochern. 24 Stunden später, Photoconvert die Pinna, wie gerade gezeigt.
Zum entsprechenden experimentellen Zeitpunkt ernten Sie die Pinnae und die zervikalen und leistenden Lymphknoten und verwenden Sie zwei Pinzettenpaare, um die ventrale und dorsale Seite jeder Pinna auseinander zu schälen. Dann legen Sie die Lymphknoten und die Pinna-Stücke, mit der Innenseite des Ohres nach unten, in einzelne Brunnen einer 24-Well-Platte mit 1 Milligramm pro Milliliter Kollagenase D und 80 Einheiten pro Milliliter Dnase in HBSS mit Kalzium und Magnesium verdünnt. Verwenden Sie zwei 29-Meter-Nadeln, um jede Lymphknotenkapsel zu necken und die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius zu platzieren.
Am Ende der Inkubation drücken Sie die verdauten Pinna und Lymphknotengewebe durch separate 70 Micron Nylon-Zell-Siebe, um einzellige Suspensionen jedes Gewebes zu erhalten. Wenn die Tumoren auf die entsprechende experimentelle Größe angewachsen sind, rasieren Sie jedes neu nachgewachsene Fell um die Tumorstelle und ziehen Sie den Tumor durch ein kreisförmiges Loch, das in ein Stück Aluminiumfolie geschnitten ist. Positionieren Sie den Tumor direkt unter der 405 Nanometer Lichtquelle und photoconvert für 5 Minuten bei 200 Milliwatt Leistung.
24 Stunden nach der Photokonversion ernten Sie die Tumore und brachialen und leistenden Lymphknoten von jedem Tier und verwenden Sie eine Schere, um die Tumore in einzelnen Brunnen einer 24-Well-Platte mit Collagenase D und DNase in HBSS zu zerkleinern. Legen Sie die Lymphknoten in separate Brunnen und necken Sie die Kapseln, wie gerade gezeigt. Nachdem Sie die Tumore für eine Stunde und die Lymphknoten für eine halbe Stunde bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, drücken Sie das verdaute Gewebe durch separate 70 Micron-Siebe, um einzellige Suspensionen jedes Gewebes zu erhalten.
Um die einzelzelligen Suspensionen durch Durchflusszytometrie zu analysieren, sammeln Sie zuerst die Milz oder das Blut von einer Kaede transgene Maus und lyse die roten Blutkörperchen mit Ammoniumchlorid Kaliumpuffer. Teilen Sie die Zellen in eine unkonvertierte Kaede FITC und eine konvertierte Kaede PE-Population und setzen Sie die einfarbigen Kaede PE-Zellen in einem Milliliter PBS in einem Brunnen einer 24-Well-Platte wieder auf, und dann die Zellen für 5 Minuten unter einer 405 Nanometer Lichtquelle bei 100 Milliwatt Leistung fotoconvert. Verwenden Sie anschließend die fotokonvertierten Kaede PE-Zellen und die nicht konvertierten Kaede FITC-Zellen, um die Photomultiplierspannungen auf 70 bis 80 % des Gesamtbereichs jedes Fluoreszenzkanals einzustellen.
Sobald die Spannungen für die Kaede-Proteine eingestellt sind, kompensieren Sie alle anderen primären Antikörperflecken mit einzelnen Fluorophor-markierten Kompensationsperlen, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Führen Sie dann die Proben auf dem Durchflusszytometer gemäß den standardmäßigen zytometrischen Analyseprotokollen durch. Einzelzellige Suspensionen, die unmittelbar nach der Photokonversion von der Ohrhaut oder den zervikal entwässernden Lymphknoten erzeugt werden, zeigen eine 78%ige Umwandlungseffizienz aller CD45-positiven Leukozyten in der Haut, ohne dass konvertierte Zellen in den entwässernden Lymphknoten beobachtet werden.
Die Quantifizierung der Anzahl der infiltrierenden CD45-positiven Leukozyten in fotokonvertierten Ohren Null und 24 Stunden nach der Umwandlung zeigt, dass die violette Lichtexposition eine statistisch signifikante Zunahme der Leukozyteninfiltration verursacht. Dieser Anstieg der CD45-positiven Leukozyteninfiltration ist jedoch im Vergleich zur Infiltration, die durch einen starken entzündungshemmenden Reiz wie das Impfvirus induziert wird, gering. Photokonversion erhöht auch die vaskuläre Permeaität in der Ohrpinne, gemessen durch Miles Assay, zusammen mit dem Hinweis, dass Die Auswirkungen von violettem Licht auf Gewebeentzündungen bei der Optimierung von Dosis, Expositionszeit und Dateninterpretation berücksichtigt werden sollten.
Die zytometrische Analyse von dissoziierten Tumorzellen von fotokonvertierten Tieren zeigt eine signifikante Umwandlung intratumoraler CD45-positiver Zellen von Kaede FITC-positiv in Kaede PE-positiv, während die Entwässerung von Lymphknotenzellen unkonvertiert bleibt. Die Photokonversionseffizienz von CD45-positiven Leukozyten variierte signifikant zwischen Tumortypen und -größen, wobei CD45-positive Leukozyten bei kleinen Melanomtumoren die effizienteste Photokonversion demonstrierten. Mit zunehmendem Tumorvolumen nimmt die Umwandlungseffizienz auf rund 50% ab. Melanin hat einen auffälligen Einfluss auf die Photokonversionseffizienz mit einer maximalen Photokonvertierung von CD45-positiven Zellen, die bei Melanin produzierenden Tumoren von nur etwa 30% bei kleineren Tumoren beobachtet werden, die auf 10% sinkt, wenn sich das Tumorvolumen 400 Kubikmillimeter nähert.
Die Untersuchung von tumorentwässernden Lymphknoten 24 Stunden nach der Photokonversion zeigt das Vorhandensein von Kaede roten positiven Immunzellen verschiedener Phänotypen und zeigt damit die Auswanderung von Leukozyten aus dem photokonvertierten Tumor. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie, um die Kinetik des stationären Zustands und des entzündeten Leukozytenumsatzes im peripheren Gewebe aufzudecken. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig sicherzustellen, dass nur das Gewebe von Interesse fotokonvertiert ist, da unbeabsichtigte Photokonvertierung des umgebenden Gewebes Ihre Ergebnisse beeinträchtigt.
Personen, die neu bei dieser Methode sind, sollten die Expositionszeit für die Umwandlung ihres Gewebes sowie die Dauer der Zeit vor der Gewebeentnahme auf der Grundlage der Dynamik von Leukozyten von Interesse optimieren.
