광변환은 병들게 된 상태의 여러 조직 부위로부터 백혈구 거주 및 출구 역학에 대한 기계론적 통찰력을 위해 백혈구 이그레의 정량적 분석을 위한 추적 가능한 생체 내 방법을 제공한다. 음, 여기에서 우리는 백과 종양에서 백혈구 추적의 유용성을 보여줍니다. 이 분석법의 적용은 다른 조직 및 질병에 대한 적용은 빛을 투여할 수 있는 능력에 의해서만 제한됩니다.
이 기술의 주요 장점은 생체 내 에서 염증 조직으로부터 의한 송신으로 면역 세포 집단을 전송하는 대신 내인성의 정량화를 허용한다는 것입니다. 염증을 유도하기 위해 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인한 후, 마이크로 파이펫을 사용하여 20 마이크로리터의 디부틸 프탈레이트 또는 DBP를 투여하고 마취케드 트랜스제닉 마우스의 귀 좌측에 투여한다. DBP가 건조할 수 있도록 허용한 후 알루미늄 호일 조각의 슬릿을 통해 귀를 당기고 양면 테이프를 사용하여 등쪽을 위쪽으로 향하는 호일에 귀를 평평하게 고정시십시오.
그런 다음 405 나노미터 광원 바로 아래에 있고 100 밀리와트의 전력으로 3 분 동안 포토 컨버터를 배치하십시오. 박시니아 감염의 경우, 미적화된 Kaede 트랜스제닉 마우스의 귀 정점에 PBS의 10 마이크로리터에서 5배 10~6개의 플라크 형성 유닛을 투여하고 피나 25번 찌르도록 마이크로피펫을 사용한다. 24 시간 후, 포토 컨버터블 피나 그냥 입증.
적절한 실험 시점에서, 피나와 자궁 경부 및 잉게인 림프절을 수확하고 각 피나의 복부와 등쪽을 떼어내는 핀셋 의 두 쌍을 사용합니다. 그런 다음 림프절과 피나 조각을 귀 안쪽을 내려다 보는 24웰 플레이트의 개별 우물에 콜라게나제 D의 밀리리터 당 1밀리그램, 칼슘과 마그네슘을 함유한 HBSS에서 희석된 DNA의 밀리리터 당 80단위를 포함하는 개별 우물에 넣습니다. 29 게이지 바늘 2개를 사용하여 각 림프절 캡슐을 열고 30 분 동안 37 °C의 플레이트를 놓습니다.
인큐베이션의 끝에서, 각 조직의 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 별도의 70 마이크론 나일론 세포 스트레이너를 통해 소화 된 피나 및 림프절 조직을 누릅니다. 종양이 적절한 실험 크기로 성장하면 종양 부위 주위에 새로 자란 털을 면도하고 알루미늄 호일 조각에 절단 된 원형 구멍을 통해 종양을 당깁니다. 종양을 405 나노미터 광원 바로 아래에 배치하고 200 밀리와트의 전력으로 5 분 동안 광변환을 합니다.
광전 후 24시간 후, 각 동물로부터 종양과 상반부 및 잉구인 림프절을 수확하고 HBSS에서 콜라게나아제 D와 DNase를 함유하는 24웰 플레이트의 개별 우물 내에서 종양을 다진 가위를 사용합니다. 림프절을 별도의 우물에 넣고 방금 설명한 대로 캡슐을 열어 놓습니다. 37°C에서 1시간 동안 종양과 림프절을 반시간 동안 배양한 후, 별도의 70 마이크론 스트레이너를 통해 소화된 조직을 눌러 각 조직의 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
혈동 세포측정에 의한 단일 세포 현탁액을 분석하기 위해 먼저 Kaede 형질전환 마우스에서 비장 또는 혈액을 수집하고 염화 칼륨 완충액으로 적혈구를 분해한다. 세포를 변환되지 않은 Kaede FITC 로 분할하고 Kaede PE 인구를 변환한 다음 24웰 플레이트의 한 웰에서 PBS의 1 밀리리터에서 단일 색상 Kaede PE 세포를 다시 중단한 다음 100밀리와트의 전력에서 405 나노미터 광원 하에서 5 분 동안 세포를 광변환합니다. 다음으로 광변환된 Kaede PE 셀과 변환되지 않은 Kaede FITC 세포를 사용하여 각 형광 채널의 총 범위의 70~80%까지 광증 전압을 설정합니다.
Kaede 단백질에 대한 전압이 설정되면 제조업체의 지침에 따라 단일 불소 표지 보상 구슬을 사용하여 다른 모든 1 차 항체 얼룩을 보상하십시오. 그런 다음 표준 유량 세포 분석 프로토콜에 따라 유동 사이토미터에서 샘플을 실행합니다. 광변환 노출 직후 귀 피부 또는 자궁 경부 배수 림프절에서 생성된 단일 세포 현탁액은 배수 림프절에서 관찰된 변환 된 세포없이 피부에있는 모든 CD45 양성 백혈구의 78 %의 변환 효율을 나타낸다.
광변환 된 귀 0 및 24 시간 변환에서 CD45 양성 백혈구에 침투하는 수의 정량화는 보라색 빛 노출이 백혈구 침투의 통계적으로 유의한 증가를 일으킨다는 것을 보여줍니다. CD45 양성 백혈구 침투의 이러한 증가는 암시니아 바이러스와 같은 강력한 염증 자극에 의해 유도된 침투에 비해 작다. 광변환은 또한 마일리지 분석으로 측정된 귀 피네의 혈관 투과성을 증가시켜, 함께 배용량, 노출 시간 및 데이터 해석을 최적화할 때 조직 염증에 대한 보라색 빛의 효과를 고려해야 한다는 것을 나타냅니다.
광변환 된 동물로부터 해리 된 종양 세포의 흐름 세포 측정 분석은 카에데 FITC 양성에서 Kaede PE 양성으로 종양 내 CD45 양성 세포의 상당한 변환을 밝혀, 림프절 세포를 배수하는 동안 변환되지 않은 상태로 유지. CD45 양성 백혈구의 광변환 효율은 종양 유형과 크기 사이에서 크게 변화했으며, CD45 양성 백혈구는 작은 흑색종 종양 내에서 가장 효율적인 광변환을 보여줍니다. 종양 부피가 증가함에 따라, 변환 효율은 특히 약 50%로 감소하며, 멜라닌 생성 종양 내에서 관찰된 CD45 양성 세포의 최대 광변환으로 광변환 효율에 눈에 띄는 영향을 미치며, 종양 부피가 400입방밀리미터에 접근함에 따라 10%로 떨어집니다.
광변환 후 24시간 동안 종양 배수 림프절을 검사하면 다양한 표현형의 Kaede 적양성 면역 세포의 존재를 드러내므로 광변환 된 종양으로부터 백혈구 이온을 입증합니다. 개발 후, 이 기술은 면역학 분야의 연구원들이 말초 조직에서 꾸준한 상태와 염증성 백혈구 회전율의 운동학을 발견할 수 있는 길을 열었습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 관심의 조직만 광변환되어 주변 조직의 부주의한 광변환이 결과를 손상시키기 때문에 하는 것이 중요합니다.
이 방법에 새로운 개인그들의 조직의 변환에 대 한 노출 시간을 최적화 해야, 조직 수집 관심의 백혈구의 역학에 따라 발생 하기 전에 시간의 기간 뿐만 아니라.
