小鼠皮肤和肿瘤淋巴血管白细胞出口的定量

光转化为白细胞出口定量分析提供了一种可跟踪的体内方法，用于对患病状态中多个组织位点对白细胞的居住和退出动力学进行机械洞察。好了，在这里我们演示了从皮肤肿瘤追踪白细胞的效用。这种测定方法的应用仅限于控制光的能力。

这项技术的主要优点是允许内源性，而不是转移免疫细胞群作为从体内发炎组织出口。为了引起炎症，在确认对脚趾捏没有反应后，使用微管将20微升二丁基邻苯二甲酸酯或DBP施用到麻醉凯德转基因小鼠的耳针的腹侧。允许 DBP 干燥后，将耳朵拉过铝箔的缝隙，并使用双面胶带将耳朵平固定到铝箔上，背侧朝上。

然后，将直接定位在 405 纳米光源下，并在 100 毫瓦的功率下进行光转换三分钟。对于 vaccinia 感染，使用微管在 10 微升 PBS 中给麻醉凯德转基因小鼠的耳针上施用 5 倍 10 至第 6 个斑块形成 vacinia 病毒的单位，并戳针脚 25 次。24 小时后， 照片转换针脚， 正如刚刚演示的。

在适当的实验时间点，收获针脚和宫颈和内结淋巴结，并使用两对钳子剥离每个针的腹和后侧。然后将淋巴结和针片，耳朵内侧朝下，放入一个24孔板的个别孔，每毫升胶原酶D含有1毫克，在HS中稀释含有钙和镁的Dnase每毫升80个单位。使用两个29测量针调开每个淋巴结胶囊，并在37摄氏度的板30分钟。

在孵化结束时，通过单独的70微米尼龙细胞过滤器按消化的针和淋巴结组织，获得每个组织的单细胞悬浮液。当肿瘤生长到适当的实验大小时，剃掉肿瘤周围新生长的毛皮，并通过一块铝箔的圆形孔将肿瘤拉下。将肿瘤直接放置到 405 纳米光源下方，并在 200 毫瓦的功率下进行光转换 5 分钟。

光转化后24小时，从每只动物中采集肿瘤、胸腺和内结，用剪刀在HSSS中含有胶原蛋白D和DNase的24孔板内，在单个孔内切碎肿瘤。将淋巴结放入单独的孔中，并像刚才演示的一样调开胶囊。在37摄氏度下将肿瘤和淋巴结孵育1小时和淋巴结半小时后，通过单独的70微米过滤器按压消化的组织，以获得每个组织的单个细胞悬浮液。

要通过流式细胞学分析单细胞悬浮液，首先从凯德转基因小鼠中收集脾脏或血液，然后用氯化铵钾缓冲液对红血球进行解塞。将细胞分成一个未转换的凯德 FITC 和一个转换的 Kaede PE 群体，将单色 Kaede PE 细胞重新在 24 孔板的一毫升 PBS 中，然后在 405 纳米光源下以 100 毫瓦功率进行光转换 5 分钟。接下来使用光转换 Kaede PE 细胞和未转换的 Kaede FITC 电池将光电倍增电压设置为每个荧光通道总范围的 70 到 80%。

一旦为Kaede蛋白设置电压，根据制造商的说明，使用标有补偿珠的单氟磷补偿珠补偿所有其他原抗体染色。然后，根据标准流量细胞测量分析方案，在流式细胞仪上运行样品。在光转化暴露后，耳皮或宫颈排空淋巴结产生的单细胞悬浮液显示皮肤中所有 CD45 阳性白细胞的转化效率为 78%，在排干淋巴结中未观察到转化细胞。

对光转化耳朵中渗透CD45阳性白细胞数量进行定量，0次和转化后24小时，发现紫罗兰光照射导致白细胞渗透在统计学上显著增加。然而，CD45阳性白细胞渗透的这种增加，相对于由有效的炎症刺激（如瓦奇尼亚病毒）引起的渗透而言，是很小的。光转化还增加了血管渗透性在耳针测量迈尔斯测定，共同表明，紫罗兰光对组织炎症的影响时，应考虑优化剂量，曝光时间和数据解释。

对光转化动物分离肿瘤细胞的流细胞学分析表明，从凯德 FITC 阳性到凯德 PE 阳性的肿瘤内 CD45 阳性细胞显著转化，同时排出淋巴结细胞仍未转化。CD45阳性白细胞的光转化效率因肿瘤类型和大小而有显著差异，小黑色素瘤肿瘤内的CD45阳性白细胞表现出最有效的光转化。随着肿瘤体积的增加，转化效率降低至50%左右，黑色素对光转化效率有显著影响，在黑色素生成肿瘤中观察到的最大光转化率在较小的肿瘤中只有30%左右，随着肿瘤体积接近400立方毫米，这种光转化率下降到10%。

光转化后24小时对肿瘤排出淋巴结的检查揭示了各种表型的Kaed red阳性免疫细胞的存在，从而证明白细胞从光转化肿瘤中转移。该技术开发后，为免疫学领域的研究人员发现了周围组织稳定状态和发炎白细胞周转的动力学铺平了道路。在尝试此过程时，必须确保只有感兴趣的组织是光转化的，因为周围组织的不经意的光转换会损害您的结果。

新方法的个体应根据感兴趣的白细胞的动态，优化组织转换的暴露时间，以及组织采集发生前的持续时间。