לכימות ליקוציט היציאה דרך כלי הלימפה מ מאתר עור וגידולים

פוטוקונום מספקת שיטת vivo הניתנת למעקב לניתוח כמותי של יציאה לויקוציטים לתובנה מכנית על מגורי לויקוציטים ודינמיקת יציאה מאתרי רקמות מרובים במצבים חיים. ובכן, כאן אנו מדגימים את התועלת של מעקב לויוציט מגידולים עוריים. היישום של יישום זה לרקמות ומחלות אחרות מוגבל רק על ידי היכולת לנהל אור.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא המאפשר כימות של אנדוגני, ולא מועבר אוכלוסיות תאים חיסוניים כמו יציאה מרקמות מודלק vivo. כדי לגרום לדלקת, לאחר אישור חוסר תגובה קמצוץ בוהן, להשתמש micropipette לנהל 20 microliters של דיבוטיל פתלט או DBP, לצד הגחוני של פינה האוזן של עכבר מהומר Kaede הרדמה. לאחר מתן אפשרות ל- DBP להתייבש, משוך את האוזן דרך חריץ בחתיכת רדיד אלומיניום ולהשתמש בקלטת דו-צדדית כדי לאבטח את האוזן שטוחה עד רדיד אלומיניום כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה.

לאחר מכן, למקם כי אתה ישירות תחת מקור אור 405 ננומטר ו photoconvert במשך שלוש דקות ב 100 מילי וואט של כוח. עבור זיהום vaccinia, להשתמש micropipette לנהל 5 פעמים 10 כדי 6 לוח להרכיב יחידות של וירוס vaccinia ב 10 microliters של PBS על הפינה האוזן של עכבר מהומר Kaede הרדמה לתקוע את פינה 25 פעמים. 24 שעות לאחר מכן, צלם את הפינה כפי שהוכח.

בנקודת הזמן הניסיונית המתאימה, לקצור את הפיני ואת בלוטות הלימפה הצוואריות והבלתי משתנות ולהשתמש בשני זוגות פינצטה כדי לקלף לגזרים את הצד הגחוני והדורסי של כל פינה. לאחר מכן מניחים את בלוטות הלימפה ואת חתיכות פינה, עם החלק הפנימי של האוזן פונה כלפי מטה, לתוך בארות בודדות של צלחת 24 באר המכיל 1 מיליגרם למיליליטר של קולגנס D ו 80 יחידות למיליליטר של Dnase מדולל HBSS המכיל סידן ומגנזיום. השתמש בשני 29 מחטי מד כדי להקניט לפתוח כל כמוסה בלוטות הלימפה ולה מניחים את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.

בסוף הדגירה, לחץ על רקמות הפינה והבלוטות הלימפה המתעכלות באמצעות מסנני תאי ניילון 70 מיקרון נפרדים כדי להשיג השעיות תא יחיד של כל רקמה. כאשר הגידולים גדלו לגודל הניסיוני המתאים, לגלח כל פרווה שזה עתה גדלה מחדש סביב אתר הגידול ולמשוך את הגידול דרך חור עגול לחתוך חתיכת רדיד אלומיניום. מקם את הגידול ישירות מתחת למקור אור 405 ננומטר ו photoconvert במשך 5 דקות ב 200 מילי וואט של כוח.

24 שעות לאחר ההתנשאות, לקצור את הגידולים ואת בלוטות הלימפה brachial ו inguinal מכל בעל חיים ולהשתמש מספריים כדי לטחון את הגידולים בתוך בארות בודדות של צלחת 24 היטב המכיל קולגנס D ו DNase ב HBSS. מניחים את בלוטות הלימפה לתוך בארות נפרדות להקניט לפתוח את הכמוסות כפי שהוכח רק. לאחר הדגירה של הגידולים במשך שעה אחת ואת בלוטות הלימפה במשך חצי שעה ב 37 מעלות צלזיוס, לחץ על הרקמות מתעכל באמצעות מסנני 70 מיקרון נפרדים כדי להשיג מתלים תא יחיד של כל רקמה.

כדי לנתח את המתלים תא יחיד על ידי ציטומטריה זרימה, הראשון לאסוף את הטחול או הדם מעכבר מהופנט Kaede וללהות את תאי הדם האדומים עם מאגר אשלגן אמוניום כלורי. לפצל את התאים לתוך אחד Kaede FITC ללא המרה אחד אחד המרה Kaede PE האוכלוסייה resuspend את צבע יחיד Kaede PE תאים במיליליטר אחד של PBS באר אחת של צלחת 24 גם, ואז פוטו להמיר את התאים במשך 5 דקות תחת מקור אור 405 ננומטר ב 100 מילי וואט של כוח. לאחר מכן השתמש בתאי Kaede PE עם ההמרה עם התמונה ותאי Kaede FITC הבלתי מעורערים כדי להגדיר את המתחים photomultiplier ל 70 עד 80% מהטווח הכולל של כל ערוץ פלואורסצנטי.

לאחר שנקבעו המתחים לחלבוני Kaede, לפצות על כל כתמי הנוגדנים העיקריים האחרים באמצעות חטיפי פיצוי יחידים עם תווית פלואורופור, בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, הפעל את הדגימות על ציטומטר הזרימה על פי פרוטוקולי ניתוח ציטומטרי זרימה סטנדרטיים. מתלים של תא יחיד הנוצרים מעור האוזן או מבלוטות לימפה מרוקנות צוואר הרחם מיד לאחר החשיפה לצילום חושפים יעילות המרה של 78%של כל ה- CD45 לויוציטים חיוביים בעור, ללא תאים מומרים שנצפו בבלוטות הלימפה המתנקזות.

כימות המספרים של CD45 לויקוציטים חיוביים חודרים באוזניים פוטו-מומרות אפס ו-24 שעות לאחר ההמרה, מגלה כי חשיפה לאור סגול גורמת לעלייה משמעותית סטטיסטית בהסתננות לויקוציטים. עלייה זו CD45 חדירה חיובית לויוציט עם זאת, הוא קטן יחסית חדירה הנגרמת על ידי גירוי דלקתי חזק כגון וירוס vaccinia. Photoconversion גם מגביר את החדירה בכלי הדם בפיני האוזן כפי שנמדד על ידי מיילס assay, יחד המציין כי ההשפעות של אור סגול על דלקת רקמות יש לקחת בחשבון בעת אופטימיזציה של מינון, זמן חשיפה ופרשנות נתונים.

ניתוח ציטומטרי זרימה של תאים סרטניים דיסוציאציה מבעלי חיים פוטו-מנוטרלים מגלה המרה משמעותית של תאים חיוביים CD45 תוך-לא מוסרי מ Kaede FITC חיובי Kaede PE חיובי, בעוד ניקוז תאי בלוטות הלימפה להישאר ללא שינוי. יעילות פוטופרונצ'ר של CD45 לויוציטים חיוביים השתנתה באופן משמעותי בין סוגי הגידולים וגדלים, עם CD45 לויוציטים חיוביים בתוך גידולים מלנומה קטנים המדגימים את פוטוקונום היעיל ביותר. ככל שנפחי הגידול גדלים, יעילות ההמרה פוחתת לכ-50% יש לציין שלמלנין יש השפעה מרשימה על יעילות פוטוקונום עם היפוך מרבי של CD45 תאים חיוביים שנצפו בתוך גידולים המייצרים מלנין של כ-30% בלבד בגידולים קטנים יותר, שיורדים ל-10% ככל שנפחי הגידול מתקרבים ל-400 מילימטרים מעוקבים.

הבדיקה של גידול ניקוז בלוטות הלימפה 24 שעות לאחר photoconversion מגלה את נוכחותם של תאי חיסון חיוביים אדומים Kaede של פנוטיפים שונים, ובכך להדגים הגירה לויוציטים מהגידול photoconverted. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה לחשוף את הקינטיקה של מצב יציב ותחלופת לויציט מודלקת ברקמה היקפית. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להבטיח כי רק רקמת העניין הוא photoconverted, כמו פוטוקונום בשוגג של הרקמה שמסביב יסכן את התוצאות שלך.

אנשים חדשים בשיטה זו צריכים לייעל את זמן החשיפה להמרה של הרקמה שלהם, כמו גם משך הזמן לפני איסוף הרקמות מתרחשת בהתבסס על הדינמיקה של לויוצייט של עניין.