Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о Теломеры, такие как дрожжи теломерных некодирующих РНК TERRA локализации, и я могу настаивать на том, что это теломер происхождения или в транс, различные cromes-mants Основное преимущество этой техники является то, что она позволяет исследователям визуализировать молекулы TERRA выразить из одного теломер в живых клетках. Демонстрация процедуры будет Клаудио Осс Пегорар и Николь Беттин, два аспиранта из моей лаборатории. Чтобы начать выращивать клетки AGS в соответствии с текстовым протоколом.
Затем, когда клетки достигают от 50 до 60%слияние transpect их с sgRNA Cas9 экспресс вектор и MS2 кассеты. На следующий день заменить культивирование среды со средой, содержащей неомицин. После этого добавить 10 микролитров 0,25%Tripsyn к каждому колодец из 96 пластины хорошо.
Используя микроскоп и маркер, отметь положение каждого клона, видимого в блюде. Замените среду культивирования неомицина на достаточное количество PBS, чтобы сформировать тонкую пленку жидкости на клонах. Используя 10 микролитровую пипетку, содержащую пять микролитров трипсина, медленно отпустите трипсин в колонию.
Разрешить трипсина, чтобы отделить клетки в течение одной минуты. Очисти колонию кончиком и сосать ее в кончик. После этого перенесите клетки из колонии в колодец 96 хорошо пластины.
Инкубировать тарелку в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем заполните колодец 150 микролитров селективной среды. Затем добавьте 100 микролитров желатина к каждому колодец из трех пластин 96 хорошо.
Инкубировать пластины при комнатной температуре в течение 30 минут, и мыть пластины с PBS в два раза. После того, как клоны достигают 90% слияния, аспирировать среды из каждого колодец пластины, и мыть пластину с PBS. Затем добавьте 30 микролитров трипсина к каждой хорошо, и инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Далее добавьте к каждой из скважин 70 микролитров селективной среды. Нарушить клетки, трубя вверх и вниз. Перенесите 30 микролитров смеси в колодец желатиновой пластины ДНК, содержащей 120 микролитров селективной среды.
Затем перенесите 30 микролитров смеси на желатинизированную замерзающую пластину, содержащую 50 микролитров среднего. Поместите ДНК в инкубатор, и позволить клеткам расти при 37 градусов по Цельсию, пока они не достигнут 90% слияния. После этого добавьте 80 микролитров ледяной ледяной морозной среды к каждому колодец замерзающей пластины.
Печать пластины с парафильмом, заменить крышку, и оберните пластину в алюминиевой фольге. Затем держите замерзающих пластин при 80 градусах по Цельсию. После того, как клоны в пластине ДНК достигнут 90% слияния, мыть пластину с PBS в два раза.
Затем вылизать клетки с 50 микролитров буфера лиза. Обложка пластины с парафильмом, заменить крышку, и оберните пластину в саран обернуть. После этого инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию на ночь.
На следующий день добавить 100 микролитров этанола раствор хлорида натрия в каждой хорошо, и позволяют ДНК осадков в течение шести часов или на ночь при комнатной температуре. Затем инвертировать пластину и мыть его три раза с 200 микролитров этанола 70% на колодец. Добавьте 20 микролитров раствора RNase A к каждому колодец пластины и инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа.
После этого используйте три микролитера геномной ДНК для усиления ПЦР и установив ПЦР-машину. Выращиваем положительные клоны ПЦР в шести хорошо пластин в соответствии с текстовым протоколом. После того, как клоны достигают 90% слияния, мыть клетки с PBS, и добавить 250 микролитров буфера лиза с Proteinase K к каждому хорошо.
Используйте сотовый скребок, чтобы соскребать клетки, и передать Lysate в 1,5 миллилитровую трубку. Инкубировать лисуат при 37 градусах по Цельсию в течение 16 часов. Добавить один миллилитр этанола в лисат, и встряхнуть энергично.
Разрешить клонов расти в F-12K среды в соответствии с текстовым протоколом. Затем добавьте аденовирус Cre-экспрессии к клеткам, как только они достигнут 70% слияния. Через 48 часов после заражения, разделить клетки на три 10 сантиметров посуды.
Затем культура третьего блюда для замораживания клеток, и РНК-экстракции. Во-первых, пластины КЛОНОВ TERRA-MS2 и диких клеток типа AGS в стеклянной нижней посуде. Затем добавьте Полибрен и MS2-GFP, выражаюющий ретровирус в среду.
Через 24 часа отбросить среду, содержащую ретровирус, и добавить свежие среды без фенола красный клеток. Наконец, с помощью перевернутого микроскопа и чувствительного изображения камеры клетки с соответствующей целью и диафрагмой. В этом протоколе были созданы и изображены клоны раковых клеток, содержащие тег последовательности MS2 в одном подтеломере.
Клоны, устойчивые к неомицину, были проверены с помощью ПЦР. Положительные клоны были выуфированы на lysed для геномного извлечения дна и южного анализа помарки. Клоны, положительное для ПЦР и анализа помарки юга, были заражены CRE-GFP, выражают аденовирус, чтобы удалить ген неомицина, присутствующий в кассете MS2.
После того, как ликвидация гена устойчивости неомицина была подтверждена, РНК, извлеченная из клонов, была протестирована на экспрессию транскриптов TERRA-MS2. Для визуализации транскриптов TERRA-MS2 в живых клетках с помощью конфокальные микроскопии выбранные клоны были заражены ретровирусом, выражают белок синтеза MS2-GFP. Транскрипты TERRA-MS2 и теломеры одновременно визуализировались в живых клетках с помощью конфокальную микроскопию путем совместного выражения белка синтеза MS2-GFP и мчерри, сплавленного теломерного связывающего белка, TRF2, в выбранных клонах.
При попытке этой процедуры важно приложить все усилия, чтобы выбрать одного клона вместо смешанной популяции клонов. После этой процедуры, другие методы, такие как ДНК FISH на хромосоме распространяется, могут быть использованы для того, чтобы визуализировать интеграцию кассеты MS2 в фиксированных клетках. После его развития, этот метод может проложить путь для исследователей в области теломер, чтобы исследовать клеточной локализации одного теломера TERRA молекул в живых клетках человека.
Не забывайте, что работа с вирусными переносчиками и радиоактивными материалами может быть крайне неопределенной. И меры предосторожности, такие как ношение лабораторных пальто, перчаток и использование плексигласовых щитов, чтобы свести к минимуму излучение всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
