Bu yöntem Telomerler hakkında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, maya telomerik olmayan kodlama RNA TERRA lokalizasyonu gibi, ve ben kökenli telomer veya trans ısrar edebilirsiniz, farklı bir cromes-mants Bu tekniğin ana avantajı araştırmacılar yaşam hücrelerinde tek bir telomer ifade TERRA molekülleri ifade görselleştirmek için izin verir. Prosedürü gösteren Claudio Oss Pegorar ve Nicole Bettin, benim laboratuvar iki lisansüstü öğrencileri olacaktır. Metin protokolüne göre AGS hücrelerini büyütmeye başlamak için.
Daha sonra hücreler %50-60'a ulaştığında sgRNA Cas9 ile transpect ve MS2 kaseti ile onları dönüştürün. Ertesi gün neomisin içeren orta ile culturing orta değiştirin. Bu 96 iyi plaka her kuyuya% 0.25 Tripsyn 10 mikrolitre ekleyin.
Bir mikroskop ve bir işaretleyici kullanarak, çanakgörünür her klonun konumunu işaretleyin. Klonlar üzerinde sıvı ince bir film oluşturmak için yeterli PBS ile Neomisin kültür ortamı değiştirin. Trypsin beş mikrolitre içeren 10 mikrolitrelik pipet kullanarak, yavaş yavaş koloni üzerine Tripsin bırakın.
Trypsin'in hücreleri bir dakika lığına ayırmasına izin verin. Ucu ile koloni kazıyın ve ucu içine emmek. Bundan sonra, koloniden hücreleri 96 kuyunun bir kuyuya aktarın.
Oda sıcaklığında beş dakika boyunca tabağı kuluçkaya yatırın. Daha sonra 150 mikrolitre seçici ortam ile kuyuyu doldurun. Daha sonra, üç 96 kuyu plakası her kuyuya 100 mikrolitre jelatin ekleyin.
Tabakları oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın ve plakaları iki kez PBS ile yıkayın. Klonlar %90 birleştiğinde, tabağın her kuyudan orta yıkın ve Plakayı PBS ile yıkayın. Sonra her kuyuya 30 mikrolitre Trypsin ekleyin ve plakayı 5 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, kuyuların her birine 70 mikrolitre seçici ortam ekleyin. Yukarı ve aşağı borular oluşturarak hücreleri bozun. Karışımın 30 mikrolitresini 120 mikrolitre seçici ortam içeren jelatinize EDILMIŞ DNA plakasının kuyuya aktarın.
Daha sonra karışımın 30 mikrolitresini 50 mikrolitre orta içeren jelatinize dondurma plakasına aktarın. DNA'yı kuvöze yerleştirin ve hücrelerin %90'lık bir araya gelene kadar 37 derecede büyümesine izin verin. Bundan sonra, dondurucu plaka her kuyuya buz gibi donma ortamı 80 mikrolitre ekleyin.
Plakayı parafilmle kapatın, kapağı değiştirin ve plakayı alüminyum folyoya sarın. O zaman dondurucu plakaları 80 derecede saklayın. DNA plakasındaki klonlar %90 birleştiğinde plakayı iki kez PBS ile yıkayın.
Daha sonra hücreleri 50 mikrolitre Lysis tamponu ile lyse. Plakayı parafilm ile kaplayın, kapağı nı değiştirin ve plakayı saran sargınla sarın. Bundan sonra, bir gecede 37 santigrat derece plaka kuluçka.
Ertesi gün her kuyuya 100 mikrolitre etanol sodyum klorür çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında altı saat veya gece boyunca DNA yağışına izin verin. Sonra plaka ters ve iyi başına% 70 etanol 200 mikrolitre ile üç kez yıkayın. Plakanın her bir kuyusuna 20 mikrolitre RNase Bir çözelti saekleyin ve plakayı bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Bundan sonra, PCR amplifikasyon için genomik DNA üç mikrolitre kullanın ve PCR makine kurulum. PCR pozitif klonları metin protokolüne göre altı kuyu plakasında büyütün. Klonlar %90 birleştiğinde hücreleri PBS ile yıkayın ve her kuyuya Proteinaz K ile 250 mikrolitre Lysis tamponu ekleyin.
Hücreleri kazımak için bir hücre kazıyıcı kullanın ve 1.5 mililitrelik bir tüp için Lysate aktarın. Lysate'yi 16 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Lysate etanol bir mililitre ekleyin ve şiddetle sallayın.
Klonların metin protokolüne göre F-12K ortamda büyümesine izin verin. Sonra hücrelere Cre-expressing adenovirüs ekleyin bir kez onlar% 70 birleştiğinde. Enfeksiyondan 48 saat sonra hücreleri 10 santimetrelik üç alana böl.
Sonra kültür hücre dondurma ve RNA çıkarma için üçüncü yemekleri. İlk olarak, terra-MS2 klonları ve cam alt tabaklarda yabani tip AGS hücreleri plaka. Sonra polibrene ve MS2-GFP orta retrovirüs ifade ekleyin.
24 saat sonra retrovirüs içeren orta atın ve hücrelere fenol kırmızı olmadan taze orta ekleyin. Son olarak, ters bir mikroskop ve hassas bir kamera görüntüsü kullanarak uygun amaç ve diyafram ile hücreleri. Bu protokolde tek bir subtelomerde MS2 dizi etiketi içeren kanser hücresi klonları oluşturuldu ve görüntülendi.
Neomisin dirençli klonlar PCR kullanılarak tarandı. Pozitif klonlar genomik DNA ekstraksiyonu ve Güney leke analizi için lysed olarak kültürlendi. PCR ve Güney leke analizi pozitif klonlar MS2 kasetmevcut Neomisin geni kaldırmak için Adenovirüs ifade CRE-GFP ile enfekte edildi.
Neomisin direnç geninin ortadan kaldırılması onaylandıktan sonra, klonlardan çıkarılan RNA TERRA-MS2 transkriptlerinin ekspresyonu için test edildi. Canlı hücrelerde TERRA-MS2 transkriptlerini konfokal mikroskopi ile görselleştirmek için seçilen klonlara MS2-GFP füzyon proteinini ifade eden retrovirüs bünyesine biçildi. TERRA-MS2 transkriptleri ve telomerler eşzamanlı olarak konfokal mikroskopi ile canlı hücrelerde MS2-GFP füzyon proteini ve seçilen klonlarda bir mCherry erimiş telomer bağlayıcı protein, TRF2 ile görselleştirildi.
Bu yordamı denerken, karma bir klon popülasyonu yerine tek bir klon seçmek için her türlü çabayı göstermen önemlidir. Bu işlemden sonra, kromozom yayılımı ndaki DNA FISH gibi diğer yöntemler, MS2 kasetinin sabit hücrelere entegrasyonunu görselleştirmek için kullanılabilir. Bu teknik, gelişiminden sonra telomerler alanında araştırmacıların yaşayan insan hücrelerindeki tek telomer TERRA moleküllerinin hücresel lokalizasyonunu keşfetmelerinin önünü açabilir.
Viral vektörler ve radyoaktif maddeler ile çalışan son derece belirsiz olabileceğini unutmayın. Ve bu işlemi yaparken, laboratuvar önlükleri, eldivenler ve radyasyonu en aza indirmek için pleksiglas kalkanlar kullanmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.
