この方法は、酵母テロメア非コードRNA TERRA局所化などのテロメアに関する重要な質問に答えるのに役立ち、起源のテロメアまたはトランス、異なるクロメトマントであると主張することができますこの技術の主な利点は、研究者が生きている細胞の単一のテロメアから発現するTERRA分子を視覚化できることです。この手順のデモンストレーションは、クラウディオ・オス・ペゴラーとニコール・ベッティン(私の研究室の2人の大学院生)です。テキストプロトコルに従ってAGS細胞の増殖を開始する。
次に、細胞が50〜60%合流に達すると、sgRNA Cas9発現ベクターおよびMS2カセットでそれらをトランスペクトする。翌日、培養培地をネオマイシンを含む培地に置き換えます。この後、96ウェルプレートの各ウェルに0.25%トリプシンの10マイクロリットルを追加します。
顕微鏡とマーカーを使用して、皿に見える各クローンの位置をマークします。ネオマイシン培養培地をクローン上に液体の薄膜を形成するのに十分なPBSに置き換えます。5マイクロリットルのトリプシンを含む10マイクロリットルのピペットを使用して、トリプシンをコロニーにゆっくりと放出する。
トリプシンがセルを1分間取り外すことを許可します。先端でコロニーを削り、先端に吸い込む。この後、コロニーから96ウェルプレートのウェルに細胞を移します。
プレートを室温で5分間インキュベートします。その後、150マイクロリットルの選択的培地で井戸を充填します。次に、3つの96ウェルプレートの各ウェルにゼラチン100マイクロリットルを加えます。
プレートを室温で30分間インキュベートし、PBSで2回洗浄します。クローンが90%合流した後、プレートの各ウェルから培地を吸引し、PBSでプレートを洗浄する。その後、各ウェルに30マイクロリットルのトリプシンを加え、プレートを摂氏37度で5分間インキュベートします。
次に、各ウェルに70マイクロリットルの選択的培地を加えます。上下にピペットを入れ、細胞を破壊します。120マイクロリットルの選択的培地を含むゼラチン化DNAプレートのウェルに30マイクロリットルの混合物を移す。
次に、混合物の30マイクロリットルを培地の50マイクロリットルを含むゼラチン化凍結板に移す。DNAをインキュベーターに入れ、細胞が90%合流するまで摂氏37度で増殖させます。この後、凍結プレートの各ウェルに80マイクロリットルの氷冷凍結培地を加えます。
パラフィルムでプレートを密封し、蓋を交換し、プレートをアルミホイルで包みます。その後、凍結プレートを摂氏80度に保ちます。DNAプレート中のクローンが90%合流した後、PBSでプレートを2回洗浄します。
その後、50マイクロリットルのライシスバッファーで細胞をライスします。パラフィルムでプレートを覆い、蓋を交換し、プレートをサランラップで包みます。この後、一晩で摂氏37度でプレートをインキュベートします。
翌日、各ウェルに100マイクロリットルのエタノール塩化ナトリウム溶液を加え、室温で6時間または一晩のDNA沈殿を可能にする。その後、プレートを反転し、ウェルあたり70%のエタノールの200マイクロリットルでそれを3回洗浄します。プレートの各ウェルにRNase A溶液20マイクロリットルを加え、37°Cで1時間インキュベートします。
この後、PCR増幅のために3マイクロリットルのゲノムDNAを使用し、PCRマシンをセットアップします。テキストプロトコルに従って、PCR陽性クローンを6つのウェルプレートで成長させます。クローンが90%合流したら、PBSで細胞を洗浄し、各ウェルにタンパク質添加Kを用いた250マイクロリットルのリシスバッファーを加えます。
細胞スクレーパーを使用して細胞を掻き取り、Lysateを1.5ミリリットルのチューブに移します。リザットを摂氏37度で16時間インキュベートします。Lysateに1ミリリットルのエタノールを加え、激しく振ります。
テキストプロトコルに従って、クローンをF-12Kメディアで拡張できるようにします。次に、70%合流に達したら、細胞にCre-発現アデノウイルスを加えます。感染から48時間後、細胞を3つの10センチメートルの皿に分ける。
次いで、細胞凍結、およびRNA抽出のための第3の皿を培養する。まず、TERRA-MS2クローンと野生型AGS細胞をガラス底皿に盛り付けます。次いで、ポリブレンとMS2-GFP発現レトロウイルスを培地に加えます。
24時間後、レトロウイルスを含む培地を廃棄し、細胞にフェノールを含まない新鮮な培地を添加した。最後に、反転顕微鏡と敏感なカメラを使用して、適切な目的と絞りを持つ細胞を画像化します。このプロトコルでは、単一サブテロメアでMS2配列タグを含む癌細胞クローンを作成し、画像化した。
ネオマイシン耐性クローンをPCRを用いてスクリーニングした。陽性クローンを、ゲノムDNA抽出およびサザンブロット分析のためにlysedで培養した。PCRおよびサザンブロット分析に陽性のクローンを、MS2カセットに存在するネオマイシン遺伝子を除去するためにアデノウイルスを発現するCRE-GFPに感染した。
ネオマイシン耐性遺伝子の排除が確認されると、クローンから抽出したRNAが、TERRA-MS2転写産物の発現について試験された。共焦点顕微鏡法により生細胞のテラ-MS2転写物を可視化するために、選択したクローンをMS2-GFP融合タンパク質を発現するレトロウイルスに感染した。TERRA-MS2転写物とテロメアは、MS2-GFP融合タンパク質とmCherry融合テロメア結合タンパク質TRF2を選択クローン中に共発現させることにより、共焦点顕微鏡を介して生細胞で同時に可視化された。
この手順を実行する場合は、クローンの混合作成ではなく、単一のクローンを選択するあらゆる努力を行うことが重要です。この手順に従って、染色体上のDNA FISHのような他の方法は、固定細胞におけるMS2カセットの統合を可視化するために使用することができる。その開発後、この技術は、テロメアの分野の研究者が生きているヒト細胞における単一テロメアTERRA分子の細胞局在化を探求する道を開く可能性がある。
ウイルスベクターや放射性物質を使用することは非常に不確実であることを忘れないでください。また、ラボコート、手袋を着用し、放射線を最小限に抑えるためにプレキシガラスシールドを使用するなど、予防措置は、この手順を実行する際に必ず取られるべきです。
