هذا البروتوكول هو تقنية قوية لتحديد سلامة وظيفية من تقاطعات ضيقة بين الخلايا في نموذج خلية من حاجز الدم البشري في الدماغ. هذا هو بروتوكول بسيط وغير مكلفة إلى حد ما يسمح بحساب نفاذية واضحة في فترة زمنية أقصر بدلا من تشغيل أطول المقايسة الحركية. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتحديد سلامة وظيفية من تقاطعات ضيقة في خلايا البطانية المخ المصابة بالجسيمات النانوية الحمض النووي البوليمر.
لبدء طلاء الخلايا، تدرج ثقافة الأنسجة مكان مع أغشية microporous في لوحة ثقافة 24 جيدا. إضافة 400 ميكرولترات من 0.15 ملليغرام لكل ملليلتر نوع الكولاجين نوع واحد في كل إدراج ثقافة الأنسجة. ثم احتضان لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية، 5٪ حاضنة ثاني أكسيد الكربون.
صخرة لوحة 24-جيدا بلطف للسماح حتى انتشار حل الكولاجين على الغشاء microporous في إدراج ثقافة الأنسجة. بعد ساعة، قم بإزالة محلول الكولاجين وغسل الغشاء الصغير بلطف مع 0.4 ملليلتر من 1X PBS العازلة. الآن، لوحة خلايا hCMEC/D3 بكثافة 50،000 الخلايا لكل سنتيمتر مربع في إدراج الخلية.
ضع لوحة 24-well مع إعداد ثقافة الأنسجة في الحاضنة للسماح بتعلق الخلايا والانتشار. احتضان لوحة لمدة سبعة أيام للسماح للخلايا للوصول إلى 100٪ التقاء. إزالة متوسطة النمو كل يومين ونقل 0.5 ملليلتر من وسائل الإعلام الطازجة قبل الدافئة في إدراج ثقافة الأنسجة.
كرر إجراء الطلاء للنشاف الغربي لتحديد التغييرات في التعبير زو-1 لتحول جسيمات نانوية للحمض النووي، ولمقايسة ATP لتحديد جدوى الخلية في الخلايا المصابة. لتحديد نفاذية واضحة لوسيفر الأصفر، في كل يوم بعد البذر، وإزالة متوسطة النمو وإضافة 1.5 ملليلتر من العازلة النقل قبل الدافئة إلى الجانب القاعدي من البئر. الآن إضافة 58.3 ميكرولترات من 20 ميكرومولار لوسيفر الأصفر حل إلى الجانب apical من كل إدراج عبر جيدا.
حفظ 50 ميكرولترات من الحل لقياسات الفلوريسنس. بعد إزالة تماما المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني المتبقية من الجانب apical، إضافة حل لوسيفر الأصفر في أسرع وقت ممكن لتجنب تجفيف الخلايا. ضمان وحدات التخزين دقيقة من حل لوسيفر الأصفر في الجانب apical.
تأكد من إضافة نفس الحجم والدقة من حل لوسيفر الأصفر في جميع إدراج. العمل بسرعة لتجنب تجفيف الخلايا. احتضان الخلايا في لوحة دوارة شاكر في 100 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
ثم قم بإزالة 30 ميكرولترات من العينة الصفراء لوسيفر من كل مقصورة apical. نقل 20 ميكرومولار لوسيفر الأصفر الحل وعينات الجانب apical إلى أنابيب المسمى مسبقا. الآن تمييع العينة عشرة أضعاف باستخدام مخزن النقل المؤقت.
قم بإزالة 500 ميكرولترتر من كل حجرة سفلي، ثم قم بنقل العينة إلى أنابيب تحمل علامات مسبقة. إعداد سلسلة من المعايير الصفراء لوسيفر للمنحنى القياسية. إضافة 100 ميكرولتررس من كل عينة apical والقياسية القاعدية إلى كل بئر من لوحة سوداء 96-well في مكررة.
استخدم قارئ الفلورسينت الصغير لقياس شدة الفلور الأصفر لوسيفر وحساب نفاذية الظاهري، كما هو موضح في نص المخطوطة. تم استخدام تأثير وقت الاستزراع على نفاذية لوسيفر الصفراء لتحديد الحركية الظاهرة لتشكيل تقاطع ضيق. انخفضت قيم نفاذية واضح بشكل ملحوظ في اليوم السابع مقارنة مع اليوم الأول، مما يشير إلى أن الحاجز أصبح أكثر إحكاما.
ثم استقرت قيم نفاذية واضح حتى اليوم 10. وهذا يعني أن تشكيل الحاجز كان كاملاً وعمليًا، مما أدى إلى انخفاض النقل شبه الخلوي الأصفر لوسيفر. تم استخدام النشاف الغربي للكشف عن التغيرات في التعبير عن البروتين ضيق تقاطع ZO-1 مع مرور الوقت.
ويمثل النطاقان الشكلين زو-1. وكشف تحليل قياس الكثافة أن قيمة بكسل ZO-1 زادت من الأيام من ثلاثة إلى سبعة بعد البذر، مما يشير إلى أن البروتين تقاطع ضيق ZO-1 شكلت باستمرار من الأيام من ثلاثة إلى سبعة. بعد معالجة استنفاد الكالسيوم في اليوم السابع بعد البذر، كان نطاق ZO-1 غير قابل للكشف تقريبًا، مما يشير إلى أن ZO-1 لم يتمكن من التشكل في غياب أيونات الكالسيوم.
كما هو مبين في النتائج، يمكن إجراء النشاف الغربي من البروتين زو-1 لتحديد التغيرات في مستوى التعبير من البروتينات تقاطع ضيق، واستكمال لوسيفر الأصفر القائم على البيانات النشاط الوظيفي. اكتشفنا أيضا أن النشاط الوظيفي للمفترقات الضيقة في الخلايا البطانية في الدماغ البشري لم يتأثر بتحول جسيمات نانوية للحمض النووي.
