Этот протокол является надежным методом для определения функциональной целостности межклеточных плотных соединений в клеточной модели гемово-мозгового барьера человека. Это простой и довольно недорогой протокол, который позволяет рассчитать кажущуюся проницаемость в более короткий период времени вместо запуска более длительного кинетического анализа. Этот метод также может быть использован для определения функциональной целостности плотных соединений в эндотелиальных клетках мозга, трансфицированных полимерными наночастицами ДНК.
Для того чтобы начать покрытие клетки, вставьте культуры ткани с микропористыми мембранами в плиту культуры 24-хорошо. Добавить 400 микролитров 0,15 миллиграмма на миллилитр коллагена типа один в каждой ткани культуры вставки. Затем инкубировать в течение одного часа в 37 градусов по Цельсию, 5%углекислого газа инкубатора.
Рок 24-хорошо пластины мягко, чтобы даже распространение коллагенового раствора на микропорозной мембраны в ткани культуры вставки. Через час удалите раствор коллагена и аккуратно вымойте микропорную мембрану 0,4 миллилитров буфера 1X PBS. Теперь, пластины hCMEC/D3 клетки с плотностью 50000 клеток на квадратный сантиметр в ячейке вставки.
Поместите 24-хорошо пластины с тканью культуры установки в инкубаторе, чтобы клеточная привязанность и пролиферацию. Инкубировать пластину в течение семи дней, чтобы клетки достигли 100% слияния. Удалите среду роста через день и перенесите 0,5 миллилитров предварительно разогретых свежих носителей в вставки культуры тканей.
Повторите процедуру покрытия для западного blotting, чтобы определить изменения в экспрессии ЗО-1 для трансфекции наночастиц ДНК, и для анализа АТФ, чтобы определить жизнеспособность клеток в трансфицированных клетках. Для определения Люцифера желтая кажущаяся проницаемость, на каждый день после посева, удалить среды роста и добавить 1,5 миллилитров предварительно разогретого транспортного буфера в базолатеральной стороне хорошо. Теперь добавьте 58,3 микролитров 20-микромолейного раствора Lucifer Yellow к апикалической стороне каждой транс-хорошо вставки.
Сэкономьте 50 микролитров раствора для измерения флуоресценции. После полного удаления остаточного буфера PBS с апической стороны, добавить Люцифер желтый раствор как можно быстрее, чтобы избежать высыхания клеток. Обеспечь точные объемы раствора Lucifer Yellow в апической стороне.
Убедитесь в том, чтобы добавить тот же и точный объем Lucifer желтый раствор во всех вставок. Работайте быстро, чтобы избежать высыхания клеток. Инкубировать клетки в роторной пластины шейкер при 100 об /мин и 37 градусов по Цельсию в течение 60 минут.
Затем удалите 30 микролитров образца Lucifer Yellow из каждого апического отсека. Перенесите 20-микромолярный раствор Lucifer Yellow и апические боковые образцы в предварительно маркированную трубку. Теперь разбавьте образец в десять раз с помощью транспортного буфера.
Удалите 500 микролитров из каждого базолатерального отсека и перенесите образец в предварительно маркированную трубку. Подготовь серию стандартов Lucifer Yellow для стандартной кривой. Добавьте 100 микролитров каждого стандартного апического и базолатерального образца к каждому колодец черной пластины 96-колодец в дубликате.
Используйте считыватель микроплесценции флуоресценции для измерения интенсивности флуоресценции Люцифера желтого цвета и расчета очевидной проницаемости, как описано в тексте рукописи. Влияние культивирования времени на проницаемость Lucifer Yellow было использовано для определения очевидной кинетики плотного образования соединения. Очевидные значения проницаемости значительно снизились на седьмой день по сравнению с первым днем, что свидетельствует о том, что барьер стал более жестким.
Затем видимые значения проницаемости стабилизировались до 10-го дня. Это подразумевало, что образование барьера было полным и функциональным, что привело к снижению параклеточного транспорта Люцифера желтого цвета. Западный blotting был использован для того чтобы обнаружить изменения в выражении плотного протеина соединения ЗО-1 над временем.
Две полосы представляют две изоформы ЗО-1. Анализ денситометрии показал, что пиксельная ценность ЗО-1 увеличилась с трех до семи дней после посева, что свидетельствует о том, что плотный белок соединения ЗО-1 образуется непрерывно с трех-семи дней. После лечения истощения кальция на седьмой день после посева, полоса ЗО-1 была почти необнаружима, что указывает на то, что ЗО-1 не смог сформироваться при отсутствии ионов кальция.
Как показано в результатах, западное blotting протеина ЗО-1 можно выполнить для того чтобы обусловить изменения в уровне выражения плотных протеинов соединения, дополняя данные функциональной деятельности Lucifer желтого цвета-основанные. Мы также обнаружили, что функциональная активность плотных соединений в эндотелиальных клетках мозга человека не была затронута трансфекцией наночастиц ДНК.
