이 프로토콜은 인간의 혈액-뇌 장벽의 세포 모델에서 세포 간 단단한 접합의 기능적 무결성을 결정하는 강력한 기술입니다. 이것은 더 긴 운동 분석기를 실행하는 대신 짧은 기간에 명백한 투과성을 계산할 수 있는 간단하고 상당히 저렴한 프로토콜입니다. 이 방법은 또한 중합체 DNA 나노 입자로 전감염된 뇌 내피 세포에서 단단한 접합의 기능적 무결성을 결정하는 데 사용될 수 있다.
세포 도금을 시작하려면 미세 다공성 멤브레인을 가진 조직 배양 삽입물을 24웰 배양 판에 넣습니다. 각 조직 배양 삽입에 밀리리터 당 0.15 밀리그램당 콜라겐 타입 1의 400 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도, 이산화탄소 인큐베이터 5%로 1시간 동안 배양합니다.
조직 배양 물자의 미세 다공막 위에 콜라겐 용액의 확산을 허용하기 위해 24웰 플레이트를 부드럽게 흔들어 놓습니다. 한 시간 후, 콜라겐 용액을 제거하고 부드럽게 1X PBS 버퍼의 0.4 밀리리터와 미세 다공성 멤브레인을 세척. 지금, 플레이트 hCMEC/D3 세포의 밀도50, 세포 삽입에 있는 평방 센티미터 당 000 세포.
세포 부착 및 증식을 허용하기 위해 인큐베이터에 조직 배양 설정이 있는 24웰 플레이트를 배치합니다. 세포가 100 %의 합류에 도달 할 수 있도록 7 일 동안 플레이트를 배양. 격일 마다 성장 매체를 제거하고 조직 배양 삽입에 미리 따뜻하게 된 신선한 매체의 0.5 밀리리터를 전송합니다.
DNA 나노 입자 트랜스펙트에 대한 ZO-1 발현의 변화를 결정하기 위해 서양 블로팅에 대한 도금 절차를 반복하고, ATP 분석이 전감염된 세포에서 세포 생존가능성을 결정한다. 루시퍼 옐로우 명백한 투과성을 결정하기 위해, 매일 파종 후, 성장 매체를 제거하고 우물의 바칼랄 측에 사전 따뜻하게 전송 버퍼의 1.5 밀리리터를 추가합니다. 이제 각 트랜스 웰 인서트의 정점에 20 마이크로 몰러 루시퍼 옐로우 용액의 58.3 마이크로 리터를 추가합니다.
형광 측정을 위해 50 마이크로리터를 저장합니다. 정물 측에서 잔류 PBS 버퍼를 완전히 제거한 후 루시퍼 옐로우 용액을 가능한 한 빨리 추가하여 셀건조를 방지합니다. 정황 측에서 루시퍼 옐로우 용액의 정확한 볼륨을 보장합니다.
모든 인서트와 동일한 정확한 볼륨의 루시퍼 옐로우 솔루션을 추가해야 합니다. 세포를 건조하지 않도록 신속하게 작업하십시오. 회전 판 셰이커에서 세포를 100 RPM및 섭씨 37도에서 60분 동안 배양합니다.
그런 다음 각 정량구에서 루시퍼 옐로우 샘플 30마이크로리터를 제거합니다. 20 마이크로몰러 루시퍼 옐로우 용액과 미리 표지된 튜브에 대한 apical 측 샘플을 전송합니다. 이제 전송 버퍼를 사용하여 샘플을 10배 희석합니다.
각 바소포탈 구획에서 500마이크로리터를 제거하고 샘플을 미리 표지된 튜브로 옮킵니다. 표준 곡선에 대한 일련의 루시퍼 옐로우 표준을 준비합니다. 각 표준 apical 및 바소포탈 샘플 100마이크로리터를 블랙 96웰 플레이트의 각 웰에 중복합니다.
형광 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 루시퍼 옐로우 형광 강도를 측정하고 원고 텍스트에 설명된 바와 같이 명백한 투과성을 계산합니다. 루시퍼 옐로우 투과성에 대한 배양 시간의 효과는 단단한 접합 형성의 명백한 운동성을 결정하는 데 사용되었습니다. 명백한 투과성 값은 장벽이 더 단단해졌다는 것을 시사하는 첫날에 비해 7일째에 크게 감소했습니다.
명백한 투과성 값은 10일째까지 안정화되었습니다. 이것은 장벽 형성이 완전하고 기능적임을 암시하여 루시퍼 옐로우 초세포 수송을 감소시켰습니다. 서양 블로팅은 시간이 지남에 따라 단단한 접합 단백질 ZO-1의 발현의 변화를 검출하기 위해 사용되었다.
두 밴드는 두 개의 ZO-1 동소형태를 나타냅니다. 밀도 분석 결과 ZO-1의 픽셀 값이 3일부터 7일까지 증가하여 단단한 접합 단백질 ZO-1이 3일부터 7일까지 지속적으로 형성되었다는 것을 시사합니다. 종전 후 7일째칼슘 고갈 처리 후 ZO-1의 대역은 거의 검출할 수 없었기 때문에 ZO-1은 칼슘 이온이 없는 상태에서 형성할 수 없었음을 나타냅니다.
결과에 나타난 바와 같이, ZO-1 단백질의 서양 블로팅은 루시퍼 옐로우 기반 기능 활성 데이터를 보완하여 단단한 접합 단백질의 발현 수준의 변화를 결정하기 위해 수행될 수 있다. 우리는 또한 인간의 뇌 내피 세포에서 단단한 접합의 기능적 활동이 DNA 나노 입자 형질에 의해 영향을받지 않았다는 것을 발견했습니다.
