Este protocolo es una técnica robusta para determinar la integridad funcional de las uniones estrechas intercelulares en un modelo celular de la barrera hematoencefálica humana. Este es un protocolo simple y bastante barato que permite calcular la permeabilidad aparente en un período de tiempo más corto en lugar de ejecutar un ensayo cinético más largo. Este método también se puede utilizar para determinar la integridad funcional de las uniones estrechas en las células endoteliales cerebrales transfectónicas con nanopartículas de ADN de polímero.
Para comenzar el enchapado celular, coloque inserciones de cultivo de tejido con membranas microporosas en una placa de cultivo de 24 pozos. Añadir 400 microlitros de 0,15 miligramos por mililitro de colágeno tipo uno en cada inserción de cultivo tisular. Luego incubar durante una hora en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Celsius, 5%.
Mece suavemente la placa de 24 pozos para permitir la propagación uniforme de la solución de colágeno sobre la membrana microporosa en los insertos de cultivo de tejido. Después de una hora, retire la solución de colágeno y lave suavemente la membrana microporosa con 0,4 mililitros de tampón 1X PBS. Ahora, placa hCMEC/D3 células con una densidad de 50.000 células por centímetro cuadrado en las inserciones de celda.
Coloque la placa de 24 pozos con la configuración de cultivo de tejido en la incubadora para permitir la fijación y proliferación celular. Incubar la placa durante siete días para permitir que las células alcancen el 100% de confluencia. Retire el medio de crecimiento cada dos días y transfiera 0,5 mililitros de medios frescos precaleados a los insertos de cultivo de tejido.
Repita el procedimiento de chapado para la hinchazón occidental para determinar los cambios en la expresión ZO-1 para la transfección de nanopartículas de ADN, y para el ensayo de ATP para determinar la viabilidad celular en las células trans infectadas. Para determinar la permeabilidad aparente Lucifer Yellow, en cada día después de la siembra, retire el medio de crecimiento y agregue 1,5 mililitros de tampón de transporte precalentado al lado basolateral del pozo. Ahora agregue 58,3 microlitros de solución de 20 micromolares Lucifer Yellow al lado apical de cada inserto trans-pozo.
Ahorre 50 microlitros de la solución para mediciones de fluorescencia. Después de eliminar completamente el búfer residual de PBS del lado apical, agregue la solución Lucifer Yellow lo más rápido posible para evitar secar las células. Asegurar volúmenes precisos de la solución Lucifer Yellow en el lado apical.
Asegúrese de agregar el mismo y preciso volumen de la solución Lucifer Yellow en todas las inserciones. Trabaje rápidamente para evitar secar las células. Incubar las células en un agitador de placa rotativa a 100 RPM y 37 grados Celsius durante 60 minutos.
A continuación, retire 30 microlitros de la muestra Lucifer Yellow de cada compartimiento apical. Transfiera la solución de 20 micromolares Lucifer Yellow y las muestras laterales apicales a tubos preetiquetados. Ahora diluya la muestra diez veces usando el búfer de transporte.
Retire 500 microlitros de cada compartimiento basolateral y transfiera la muestra a tubos preetiquetados. Prepara una serie de estándares Lucifer Yellow para la curva estándar. Agregue 100 microlitros de cada muestra apical y basolateral estándar a cada pozo de una placa negra de 96 pozos por duplicado.
Utilice un lector de microplacas de fluorescencia para medir la intensidad de la fluorescencia Lucifer Yellow y calcular la permeabilidad aparente, como se describe en el texto manuscrito. El efecto del tiempo de cultivo en Lucifer Yellow permeabilidad se utilizó para determinar la cinética aparente de la formación de unión estrecha. Los valores aparentes de permeabilidad disminuyeron significativamente en el día siete en comparación con el primer día, lo que sugiere que la barrera se volvió más estrecha.
Los valores aparentes de permeabilidad se estabilizaron hasta el día 10. Esto implicó que la formación de la barrera fuera completa y funcional, lo que resultó en una disminución del transporte paracelular Lucifer Yellow. La hinchazón occidental se utilizó para detectar cambios en la expresión de la proteína de unión estrecha ZO-1 con el tiempo.
Las dos bandas representan las dos isoformas ZO-1. El análisis de densitometría reveló que el valor de píxel de ZO-1 aumentó de los días tres a siete después de la siembra, lo que sugiere que la proteína de unión apretada ZO-1 se formó continuamente desde los días tres hasta siete. Después del tratamiento de agotamiento del calcio en el día siete después de la siembra, la banda de ZO-1 era casi indetectable, lo que indica que ZO-1 no pudo formarse en ausencia de iones de calcio.
Como se muestra en los resultados, se puede realizar una hinchazón occidental de la proteína ZO-1 para determinar los cambios en el nivel de expresión de las proteínas de unión ajustada, complementando los datos de actividad funcional basados en Lucifer Yellow. También descubrimos que la actividad funcional de las uniones estrechas en las células endoteliales cerebrales humanas no se vio afectada por la transfección de nanopartículas de ADN.
