Dieses Protokoll ist eine robuste Technik, um die funktionelle Integrität interzellulärer enger Knoten in einem Zellmodell der menschlichen Blut-Hirn-Schranke zu bestimmen. Dies ist ein einfaches und ziemlich kostengünstiges Protokoll, das es ermöglicht, die scheinbare Permeabilität in einem kürzeren Zeitraum zu berechnen, anstatt einen längeren kinetischen Assay auszuführen. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die funktionelle Integrität von engen Knoten in Gehirn endotheliale Zellen transfiziert mit Polymer-DNA-Nanopartikeln zu bestimmen.
Um mit der Zellbeschichtung zu beginnen, legen Sie Gewebekultureinsätze mit mikroporösen Membranen in eine 24-Well-Kulturplatte. Fügen Sie 400 Mikroliter 0,15 Milligramm pro Milliliter Kollagen Typ eins in jedem Gewebekultureinsatz hinzu. Dann für eine Stunde in einem 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid-Inkubator inkubieren.
Rocken Sie die 24-Well-Platte sanft, um eine gleichmäßige Ausbreitung der Kollagenlösung über die mikroporöse Membran in den Gewebekultureinsätzen zu ermöglichen. Nach einer Stunde die Kollagenlösung entfernen und die mikroporöse Membran vorsichtig mit 0,4 Millilitern 1X PBS Puffer waschen. Jetzt, Platte hCMEC / D3-Zellen mit einer Dichte von 50 000 Zellen pro Quadratzentimeter in den Zelleneinsätze.
Legen Sie die 24-Well-Platte mit Gewebekultur-Setup in den Inkubator, um Zellanhaftung und Proliferation zu ermöglichen. Inkubieren Sie die Platte für sieben Tage, damit die Zellen 100% Konfluenz erreichen können. Entfernen Sie das Wachstumsmedium jeden zweiten Tag und übertragen Sie 0,5 Milliliter vorgewärmter Frischmedien in die Gewebekultureinsätze.
Wiederholen Sie das Beschichtungsverfahren für Western Blotting, um Veränderungen der ZO-1-Expression für die DNA-Nanopartikeltransfektion zu bestimmen, und für den ATP-Test, um die Zelllebensfähigkeit in transfezierten Zellen zu bestimmen. Zur Bestimmung der scheinbaren Durchlässigkeit von Luzifergelb entfernen Sie an jedem Tag nach der Aussaat das Wachstumsmedium und fügen Sie 1,5 Milliliter vorgewärmten Transportpuffers auf die basolaterale Seite des Brunnens. Fügen Sie nun 58,3 Mikroliter 20-Mikromolar Lucifer Yellow Lösung auf der apikalen Seite jeder Trans-Well-Einsatz.
Sparen Sie 50 Mikroliter der Lösung für Fluoreszenzmessungen. Nachdem Sie den Rest-PBS-Puffer vollständig von der apikalen Seite entfernt haben, fügen Sie die Luzifer-Gelb-Lösung so schnell wie möglich hinzu, um eine Trocknung der Zellen zu vermeiden. Stellen Sie genaue Volumina der Lucifer Yellow-Lösung auf der apikalen Seite sicher.
Stellen Sie sicher, dass Sie das gleiche und genaue Volumen der Lucifer Yellow-Lösung in allen Einsätzen hinzufügen. Arbeiten Sie schnell, um das Trocknen der Zellen zu vermeiden. Inkubieren Sie die Zellen in einem Drehplatten-Shaker bei 100 Umdrehungen pro Minute und 37 Grad Celsius für 60 Minuten.
Dann entfernen Sie 30 Mikroliter der Lucifer Yellow Probe aus jedem apikalen Fach. Übertragen Sie die 20-Mikromolar Lucifer Yellow-Lösung und die apikalen Seitenproben in vorbeschriftete Röhrchen. Verdünnen Sie nun die Probe mit dem Transportpuffer verzehnfacht.
Entfernen Sie 500 Mikroliter aus jedem basolateralen Fach und übertragen Sie die Probe in vorbeschriftete Schläuche. Bereiten Sie eine Reihe von Lucifer Yellow-Standards für die Standardkurve vor. Fügen Sie 100 Mikroliter jeder Standard-Apikal- und Basolateral-Probe zu jedem Brunnen einer schwarzen 96-Well-Platte in doppelter Ausführung hinzu.
Verwenden Sie einen Fluoreszenz-Mikroplattenleser, um die Luzifergelbe Fluoreszenzintensität zu messen und die scheinbare Permeabilität zu berechnen, wie im Manuskripttext beschrieben. Der Effekt der Kultivierungszeit auf die Durchlässigkeit von Luzifergelb wurde verwendet, um die scheinbare Kinetik der engen Knotenbildung zu bestimmen. Die sichtbaren Permeabilitätswerte sanken am siebten Tag im Vergleich zum ersten Tag deutlich, was darauf hindeutet, dass die Barriere enger wurde.
Die scheinbaren Permeabilitätswerte stabilisierten sich dann bis zum 10. Tag. Dies implizierte, dass die Barrierebildung vollständig und funktionell war, was zu einem verringerten luzifergelben parazellulären Transport führte. Western Blotting wurde verwendet, um Veränderungen in der Expression des engen Knotenproteins ZO-1 im Laufe der Zeit zu erkennen.
Die beiden Bänder stellen die beiden ZO-1-Isoformen dar. Die Densitometrie-Analyse ergab, dass der Pixelwert von ZO-1 von den Tagen drei bis sieben nach der Aussaat stieg, was darauf hindeutet, dass sich das enge Knotenprotein ZO-1 kontinuierlich von den Tagen drei bis sieben gebildet hat. Nach der Kalziumabbaubehandlung am siebten Tag nach der Aussaat war das Band von ZO-1 fast nicht nachweisbar, was darauf hindeutet, dass ZO-1 sich ohne Kalziumionen nicht bilden konnte.
Wie in den Ergebnissen gezeigt, kann eine westliche Blotting von ZO-1-Protein durchgeführt werden, um Veränderungen in der Expressionsebene von engen Junction-Proteinen zu bestimmen, die die Lucifer Yellow-basierten funktionellen Aktivitätsdaten ergänzen. Wir entdeckten auch, dass die funktionelle Aktivität enger Kreuzungen in menschlichen Gehirnendothelzellen nicht durch DNA-Nanopartikeltransfektion beeinflusst wurde.
