このプロトコルは、ヒト血液脳関門の細胞モデルにおける細胞間タイトな接合の機能的完全性を決定するための堅牢な技術である。これは、より長い運動アッセイを実行するのではなく、より短い期間で見かけの透過性を計算することを可能にする、シンプルでかなり安価なプロトコルです。この方法は、ポリマーDNAナノ粒子をトランスフェクトした脳内皮細胞における密着接合の機能的完全性を決定するためにも使用することができる。
細胞メッキを開始するには、微多孔膜を用いた組織培養挿入物を24ウェル培養プレートに入れる。各組織培養インサートに0.15ミリグラムのコラーゲンタイプ1の400マイクロリットルを加えます。その後、摂氏37度、5%の二酸化炭素インキュベーターで1時間インキュベートします。
24ウェルプレートを穏やかに揺らし、組織培養インサート内の微多孔膜上にコラーゲン溶液を均等に広げます。1時間後、コラーゲン溶液を取り出し、0.4ミリリットルの1X PBSバッファーで微多孔膜を静かに洗います。今度は、セルインサートの1平方センチメートルあたり50,000細胞の密度を有するプレートhCMEC/D3細胞。
培養器に組織培養を組み込んだ24ウェルプレートを置き、細胞の付着と増殖を可能にします。プレートを7日間インキュベートし、細胞が100%合流に達するようにします。1日おきに成長培地を取り除き、0.5ミリリットルのプリ温めた新鮮な培地を組織培養インサートに移します。
ウェスタンブロッティングのめっき処理を繰り返して、DNAナノ粒子トランスフェクションに対するZO-1発現の変化を決定し、ATPアッセイでトランスフェクトされた細胞の細胞生存率を決定します。ルシファーイエローの透視透過性を決定するために、播種後の毎日の日に、成長培地を取り除き、1.5ミリリットルの予熱輸送バッファーをウェルのバソラテラ側に加える。20マイクロモルルルシファーイエロー溶液の58.3マイクロリットルを各トランスウェルインサートのアペカル側に加えます。
50マイクロリットルの溶液を、蛍光測定用に保存します。補助側から残留PBSバッファーを完全に除去した後、細胞の乾燥を避けるために、できるだけ早くルシファーイエロー溶液を添加します。アペカル側のルシファーイエロー溶液の正確な容積を確保する。
すべての挿入にルシファーイエロー溶液の同じ、正確なボリュームを追加することを確認してください。細胞の乾燥を避けるために迅速に作業します。100 RPM、摂氏37度で細胞を60分間インキュベートします。
次に、各尖文コンパートメントからルシファーイエローサンプルの30マイクロリットルを取り除きます。20マイクロモルルルシファーイエロー溶液とアペカル側サンプルを事前ラベルチューブに移します。次に、輸送バッファーを使用してサンプルを 10 倍希釈します。
各バソラテラコンパートメントから500マイクロリットルを取り除き、サンプルを事前ラベル付きチューブに移します。標準曲線の一連のルシファーイエロー規格を用意します。黒い96ウェルプレートの各ウェルに、標準的なアペカルサンプルとバソラショナルサンプルの100マイクロリットルを複製します。
蛍光マイクロプレートリーダーを使用して、ルシファーイエロー蛍光強度を測定し、原稿テキストに記載されているように見かけの透過性を計算します。培養時間がルシファーイエロー透過性に及ぼす影響は、密接点形成の見かけの運動学を決定するために用いられた。見かけの透過性値は、初日と比較して7日目に有意に減少し、障壁がきつくなったことを示唆した。
その後、見かけの透過率値は10日目まで安定した。これは、バリア形成が完全かつ機能的であることを暗示し、その結果、ルシファーイエローの細胞内輸送が減少した。ウェスタンブロッティングは、時間の経過に伴う密接接合タンパク質ZO-1の発現の変化を検出するために使用された。
2 つのバンドは、2 つの ZO-1 アイソフォームを表します。密度測定法の解析では、ZO-1の画素値が3日目から7日目のシード後まで増加し、タイトな接合タンパク質ZO-1が3日目から7日目まで絶えず形成されることを示唆した。7日目の播種後のカルシウム枯渇処理後、ZO-1のバンドはほとんど検出不能であり、カルシウムイオンが存在しない場合にZO-1が形成できなかったことを示す。
結果に示すように、ZO−1タンパク質のウェスタンブロッティングは、密接結合タンパク質の発現レベルの変化を決定し、ルシファーイエローベースの機能活性データを補完する。また、ヒト脳内皮細胞における密接点の機能活性は、DNAナノ粒子トランスフェクションの影響を受けないことを発見した。
