والغرض من هذا الإجراء هو أن يكون نموذج السابقين vivo لتقييم العظام إعادة عرض وإعادة البيئة الدقيقة الورم العظام باستخدام ثقافة الكالفاريا أو ثقافة المشتركة مع الخلايا السرطانية. معظم تقنية الكالفاريا هي نظام استزراع الأعضاء باستخدام عظام الكالفاريا من فئران حديثي الولادة لتقييم إعادة عرض العظام. يمكنك اختبار الإمكانات العلاجية للجزيئات المتنوعة، أو حتى إعادة إنشاء بيئة الورم العظمي الدقيقة عند استخدام الثقافات المشتركة مع الخلايا السرطانية.
كل ذلك في بسيطة وسهلة في وقت قصير وتكلفة منخفضة. والهدف من هذه التقنية هو أن يكون أداة لتقييم تجديد العظام في بيئة العظام السرطانية، وذلك باستخدام نموذج فيفو السابقين من ثقافة الجهاز الكالفاري الماوس. أولاً، حدد الجرو الماوس وضعه تحت غطاء محرك السيارة.
نستخدم الكالفاريا من جرو فأر عمره خمسة إلى سبعة أيام. خذ الرأس مع الحقنة، وقطع الجلد، ومسح منطقة فروة الرأس بما فيه الكفاية لتشريح الكالفاريا. التعرف على خياطة الجمجمة، القوس، الإكلالي، و لامدويد.
جعل قطع مستقيم على طول الغرز lambdoid، إلى حوالي مستوى العين. قطع على كل جانب، من الغرز لامدويد نحو خياطة التاجية. في زاوية 45، وجعل قطع آخر لربط نهاية القطع مع قطع من fontanel الأمامية.
من المهم للغاية تحديد خياطة الجمجمة ، القوس ، الجبهية ، الإكليلية ، اللمدويد ، لضمان إدراج الأنسجة الصحيحة وتحليل الأنسجة. مع النصائح الدقيقة ملقط، وإزالة الكالفاريا، ووضعها على غطاء طبق بيتري. مع مشرط، وجعل قطع مستقيم من فونتانيل الخلفي على طول خياطة القوس من خلال خياطة الإكلال.
يتم الحصول على اثنين من الهيمكالفاريا. اختيار كل كالفاريا مع ملقط، ووضعها في طبق بيتري جديد مع برنامج تلفزيوني. بالنسبة للثقافة، ضع الهيمكالفاريا في طبق ثقافة من الأنسجة يحتوي على 24 بئرًا، ويحتوي على ملليلتر واحد من الوسائط، وحضن لمدة 24 ساعة عند درجة 37 درجة.
يمكننا أيضا استخدام الثقافات الكالفاري الأولية لإعادة إنتاج البيئة الدقيقة الورم العظام لارتشاف العظام. للقيام بذلك، ونحن شارك في زراعة الكالفاريات مع الخلايا السرطانية، أو مع وسائل الإعلام مكيفة من الخلايا السرطانية. بعد 24 ساعة، قم بإزالة الوسائط واستبدلها بوسائط تحتوي على العلاج الذي ترغب في اختباره.
إذا كنت ترغب في تقييم الخلايا السرطانية وتفاعلات العظام، أو إعادة إنشاء بيئة الورم العظام الدقيقة، تمرير الكالفاريا إلى لوحة مرفق خلوي منخفضة، لتجنب تعلق الخلايا السرطانية إلى لوحة. تبسينيزي الخلايا السرطانية، عدها، ووضعها بعناية في الجزء العلوي من هيميكيلافاريا. يمكنك أيضا استخدام وسائل الإعلام الشرطية من الخلايا السرطانية، واستخدامها لاحتضان hemicalvaria.
احتضان لمدة ستة إلى سبعة أيام في 37 درجة، مع خمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون. في اليوم الثالث، قم بتغيير الوسائط ومتابعة الحضانة. يعتمد عدد الخلايا التي تستخدم في الثقافة المشتركة على الخط الخلوي السرطاني.
تحتاج، أولا، لتحسين عدد الخلايا التي هناك حاجة إلى ذلك للحث على استجابة في واحد. بعد الثقافة، والكالفاريا تمر من خلال عملية التثبيت، decalcification، والparffin جزءا لا يتجزأ. وعلاوة على ذلك، يتم تقسيم الأنسجة في microtome، ملطخة، ويتم إجراء تحليل الهستومورومتري.
إدراج الكالفاريا يمكن أن تكون خادعة. للتأكد من أن الأنسجة محمية أثناء إدراج، يمكنك وضع الأنسجة بين الإسفنج أو استخدام ورقة الأنسجة أو ورقة ماصة أخرى من قبل لوضعها في الكاسيت. لمعالجة الأنسجة، التفاف hemicalvaria في ورقة الأنسجة.
ثم، وضعه في شريط التضمين، وإصلاح في المخزن المؤقت المحايد في formalin، لمدة 24 ساعة في أربع درجات. لتجمّع الكالفاريّة، ضع الكاسيت في 10٪ EDTA لمدة 48 ساعة بأربع درجات. معالجة كاسيت الأنسجة مع hemicalvaria في معالج الأنسجة التلقائي.
اتبع دورة تناوب يومية منتظمة ، ثم ، وتشمل في البارافين. للقطع، وقطع أربعة أقسام microtic مع microtome، جبل المقاطع على الشرائح المجهر الزجاجي، وصمة عار مع الهماتكسلين، إيوسين. تم استخدام تحليل الأنسجة لإجراء التحليل الكمي لسطح العظام ومناطق إعادة عرض العظام.
تم تحليل صور الكالفاريا في الأيام السبعة باستخدام برنامج التصوير. بالنسبة للتقييم الكمي، أولاً، حدد المجال للتحليل. ننظر في أقسام على telopa حيث أربعة X لتحديد التوجه وخيوط.
حدد خياطة الإكلال، وحدد سطح العظام الطويل على جانب واحد، ثم السطح القصير على الجانب الآخر. تحت التكبير 40X، وتحديد خياطة الإكليلية ونقل اثنين أو ثلاثة حقول بصرية بعيدا عن خياطة، على طول السطح الطويل. التقاط صورة من هذه المنطقة لتحليلها.
يمكنك استخدام برامج الصور لتحليل السلامة الهيكلية للعظم. التحليل الهستوموروميتري الكمي للسمك ومنطقة العظام في هيميكيلا يمكن القيام به. يعتمد تحليل الكالفاريا الصحيح على تضمين جيد وتوجه مناسب للحصول على نتائج هِسولوجية متسقة.
تأكد من استخدام ما لا يقل عن ثلاثة كالفاريا لكل حالة تجريبية. هنا، يمكننا أن نرى هيكل العظام. في البرتقال، لوحظ العظام.
يمكننا أيضا أن نرى وجود periosteum، ostocyte، إندوستيوم، وأجزاء أخرى من العظام. في حالتنا، نستخدم الأنسولين لزيادة إعادة عرض العظام. مقارنة مع السيطرة، يمكننا أن نرى زيادة كبيرة في منطقة العظام.
هنا، يمكننا أن نرى تأثير MDA-MB-231 خط الخلية على نموذج كالفاريا. يمكننا أن نرى، بالمقارنة مع السيطرة، أن وجود الخلايا السرطانية تحفز العوامل العظمية التي تحفز تدمير العظام. استخدمنا نموذج الكالفاريا لقياس تجديد العظام وتفاعلات الخلايا السرطانية العظمية من خلال الثقافات المشتركة مع الخلايا السرطانية وعلم الأنسجة.
كما نقوم أيضاً بالتحقق من صحة بياناتنا عن طريق التحقق الكمي من معدل الـ PCR في الوقت الحقيقي. هذا النموذج السابقين vivo لديها ميزة كثيرة، مثل منظمة ثلاثية الأبعاد ويتم الحفاظ على التنوع الخلوي للعظم، ويمكن التحكم في الظروف التجريبية. إلى جانب ذلك، فإن النموذج بسيط، يمكنك أن ترى النتائج في فترة قصيرة من الزمن، وأنها منخفضة التكلفة.
ويمكن دمجها مع تقنيات أخرى، مثل الـ PCR الكمية في الوقت الحقيقي، والمجهر، والمجهرية.
