Цель этой процедуры состоит в том, чтобы иметь модель ex vivo для оценки ремоделирования костей и воссоздания микроокниронии опухолевых костей с использованием культуры кальварии или совместной культуры с раковыми клетками. Большинство кальварии техника системы культуры органов с использованием кальварии кости неонатальных мышей для оценки костной ремоделирования. Вы можете проверить терапевтический потенциал различных молекул, или даже воссоздать микрооквидеронирования костной опухоли, когда вы используете со-культуры с раковыми клетками.
Все это в простой и простой анализ в течение короткого времени и низкой стоимости. Цель этого метода состоит в том, чтобы иметь инструмент для оценки регенерации костей в микроокноронации рака кости, используя ex vivo модель мыши кальвариальной культуры органов. Во-первых, выберите щенка мыши и поместите его под капот.
Мы используем кальварию от пяти до семи дней детенышей мыши. Возьмите голову со шприцем, вырезать кожу, и очистить область кожи головы достаточно для вскрытия голгофы. Определите швы черепа, стрельца, коронала и лямбдоидов.
Сделать сделать прямой разрез вдоль швов ягненка, примерно до уровня глаза. Вырезать с каждой стороны, от овсяных швов к корональной швы. Под углом 45 сделайте еще один разрез, чтобы соединить конец разреза, сделанного с разрезом переднего фонтанеля.
Чрезвычайно важно определить швы черепа, сагиттал, лобной, корональный, лямбдоид, чтобы гарантировать правильное включение тканей и гистологический анализ. С тонкой стиппы советы, удалить кальварии, и положить его на крышку чашки Петри. С скальпелем, сделать прямой разрез из задней фонтанель вдоль sagittal шва через корональный шов.
Получены две гемикалварии. Выберите каждую кальварию с типсами, и поместите их в новую чашку Петри с PBS. Для культуры поместите гемикалварию в 24-хорошо ткани культуры пластины, содержащей один миллилитр средств массовой информации, и инкубировать в течение 24 часов при 37 градусов.
Мы также можем использовать первичные кальвариальные культуры для воспроизведения микроокноронности опухоли и кости для ресорбции костей. Для этого мы совместно культури кальварий с раковыми клетками, или с условными средствами массовой информации из раковых клеток. 24 часа спустя удалите средства массовой информации и замените их средствами массовой информации, содержащими лечение, которое вы хотели бы протестировать.
Если вы хотите оценить раковые клетки и костные взаимодействия, или воссоздать микроокурение опухоли кости, передать кальварии низкоклеточной пластины крепления, чтобы избежать присоединения раковых клеток к пластине. Трипсинизировать раковые клетки, считать их, и поместите их тщательно в верхней части гемикалии. Вы также можете использовать условные средства массовой информации из раковых клеток, и использовать его для инкубации гемикалварии.
Инкубация в течение шести-семи дней при 37 градусах, с пятью процентами CO2. На третий день, изменить средства массовой информации и продолжать инкубации. Количество клеток, использующих в совместной культуре зависит от рака клеточной линии.
Вам нужно, во-первых, оптимизировать количество ячеек, которые необходимы, чтобы вызвать ответ в одном. После культуры, кальварии проходят через процесс фиксации, наклейки, и парафин-встроенных. Кроме того, ткани поделены в микротоме, окрашены, и гистоморфометрический анализ выполняется.
Включение кальварии может быть сложно. Чтобы убедиться, что ткань защищена во время включения, вы можете положить ткань между губками или использовать бумагу или другую абсорбянтную бумагу, прежде чем положить его в кассету. Для обработки тканей, оберните hemicalvaria в бумаге ткани.
Затем поместите его в встраиваемую кассету и зафиксните в нейтральном буфере в формалине в течение 24 часов при четырех градусах. Чтобы очистить кальварию, поместите кассету в 10%EDTA в течение 48 часов при четырех градусах. Обработать тканевых кассет с гемикалварией в автоматическом процессоре ткани.
Следуйте регулярному циклу вращения день, то, включают в парафин. Для секций вырежьте четыре микротическими секциями с микротомом, смонтировать секции на стеклянные микроскопические горки и окрашивать гематоксилином, эозином. Гистологический анализ был использован для выполнения количественного анализа поверхности кости и области ремоделирования костей.
Изображения кальварии за семь дней были проанализированы с помощью программного обеспечения для визуализации. Для количественной оценки, во-первых, определить область для анализа. Посмотрите в разделах на telopa, где четыре X для определения ориентации и швов.
Определите корональной шов, и определить длинную поверхность кости с одной стороны, а затем короткую поверхность с другой. Под увеличением 40X, определить корональной швы и переместить два или три оптических полей от шва, вдоль длинной поверхности. Захват изображения этой области для анализа.
Вы можете использовать программное обеспечение изображений для анализа структурной целостности кости. Количественный гистоморфометрический анализ толщины и костной области гемикалия может быть сделано. Правильный анализ кальварии зависит от хорошего встраивания и правильной ориентации для последовательных гистологических результатов.
Не забудьте использовать по крайней мере три кальварии в экспериментальном состоянии. Здесь мы можем увидеть структуру кости. В оранжевом цвете наблюдается кость.
Мы также можем видеть наличие периостея, остоцита, эндостея и других частей кости. В нашем случае, мы используем инсулин для увеличения ремоделирования костей. По сравнению с контролем, мы можем увидеть значительное увеличение в области кости.
Здесь мы видим влияние клеточной линии MDA-MB-231 на кальварию модели. Мы можем видеть, по сравнению с контролем, что наличие раковых клеток вызывают остеолитические факторы, которые стимулируют разрушение костей. Мы использовали модель кальварии для измерения регенерации костей и взаимодействия раковых клеток и костей совместно культур с раковыми клетками и гистологией.
Мы также проверяем наши данные количественным ПЦР в режиме реального времени. Эта модель ex vivo имеет много преимуществ, как трехмерная организация и клеточное разнообразие кости сохранены, и экспериментальные условия можно контролировать. Кроме того, модель проста, вы можете увидеть результаты в течение короткого периода времени, и это недорого.
И его можно сочетать с другими методами, такими как количественный ПЦР в реальном времени, микроскопия и микроКТ.
