Bu işlemin amacı, kemik remodeling değerlendirmek ve tümör-kemik mikroçevre calvaria kültürü veya kanser hücreleri ile co-kültür kullanarak yeniden oluşturmak için bir ex vivo modeli olmasıdır. Kalvari tekniğinin çoğu, kemik remodelingini değerlendirmek için yenidoğan farelerden kalvaria kemikleri kullanan bir organ kültür sistemidir. Farklı moleküllerin terapötik potansiyelini test edebilir, hatta kanser hücreleri ile co-kültürleri kullandığınızda kemik tümörü mikroortamı yeniden.
Tüm bu kısa bir süre ve düşük bir maliyetle basit ve kolay bir tayiş. Bu tekniğin amacı, fare kalvariyal organ kültürünün ex vivo modelini kullanarak, kanser kemik mikroortamında kemik rejenerasyonu değerlendirmek için bir araç olmasıdır. İlk olarak, bir fare yavrusu seçin ve başlık altına yerleştirin.
5-7 günlük fare yavrularından calvaria kullanıyoruz. Şırıngayla baş alın, deriyi kesin ve kalvariyi incelemek için kafa derisi alanını temizleyin. Kafatası, sagittal, koronal ve lambdoids dikişleri tanımlayın.
Göz seviyesine lambdoid dikişler boyunca düz bir kesim yapmak. Lambdoid sütürlerden koronal dikişe doğru her iki tarafı da kesin. 45 açı, ön fontanel kesim ile yapılan kesim ucunu bağlamak için başka bir kesim yapmak.
Doğru doku dahil etme ve histoloji analizini garanti altına almak için kafatası sütür, sagittal, frontal, koronal, lambdoid tanımlamak son derece önemlidir. Ince ipuçları forceps ile, calvaria çıkarın ve petri çanak kapağı üzerine koyun. Bir neşter ile, koronal sütür ile sagittal sütür boyunca posterior fontanel düz bir kesim yapmak.
İki hemicalvarias elde edilir. Her calvaria'yı çifenler ile toplayın ve PBS'li yeni bir Petri kabına yerleştirin. Kültür için, 24-iyi doku kültür plakası, medya bir mililitre içeren hemicalvaria yerleştirin ve 37 derece 24 saat kuluçka.
Ayrıca kemik rezorpsiyonu için tümör-kemik mikroçevresini yeniden üretmek için birincil kalvarial kültürleri de kullanabiliriz. Bunu yapmak için, biz kanser hücreleri ile ortak kültür calvarias, ya da kanser hücrelerinden koşullu medya ile. 24 saat sonra, ortamı çıkarın ve test etmek istediğiniz tedaviyi içeren ortamla değiştirin.
Kanser hücrelerini ve kemik etkileşimlerini değerlendirmek veya tümör-kemik mikroçevresini yeniden oluşturmak istiyorsanız, kanser hücrelerinin tabağa bağlanmasını önlemek için kalvariyi düşük hücresel bağlanma plakasına geçirin. Kanser hücrelerini deneyin, sayılayın ve hemicalvarianın en üstüne dikkatlice yerleştirin. Ayrıca kanser hücrelerinden koşullu medya kullanabilirsiniz, ve hemicalvaria kuluçka için kullanabilirsiniz.
37 derecede 6-7 gün kuluçkaya yat, %5 CO2 ile. Üçüncü gün, medya yıkın ve kuluçkaya devam edin. Co-kültür kullanan hücrelerin sayısı kanser hücresel hattına bağlıdır.
Öncelikle, bir yanıt ı ikna etmek için gereken hücre sayısını optimize etmek gerekir. Kültürden sonra, calvaria fiksasyon, kireçlenme ve parafin gömülü bir süreçten geçer. Ayrıca dokular mikrotom, lekeli olarak kesitlenir ve histomorfometrik analiz yapılır.
Calvaria dahil zor olabilir. Doku dahil sırasında korunduğundan emin olmak için, süngerler arasında doku koymak veya kaset koymak için önce bir doku kağıt veya diğer emici kağıt kullanabilirsiniz. Doku işleme için, kağıt mendil hemicalvaria sarın.
Sonra, bir gömme kaset içine yerleştirin ve formalin nötr tampon düzeltmek, dört derece 24 saat boyunca. Calvaria dekalsitif etmek için, dört derece 48 saat boyunca% 10 EDTA içine kaset yerleştirin. Bir otomatik doku işlemci içinde hemicalvaria ile doku kasetleri işleme.
Normal bir gün dönüş döngüsü izleyin, sonra, parafin ekleyin. Kesit için, bir mikrotom ile dört mikrotik bölüm kesti, cam mikroskop slaytlar üzerine bölümleri monte ve hematoksilin, eozin ile leke. Histoloji analizi kemik yüzeyi ve kemik remodeling alanlarının kantitatif analizini yapmak için kullanıldı.
Calvaria'nın yedi gün deki görüntüleri görüntüleme yazılımı kullanılarak analiz edildi. Nicel değerlendirme için öncelikle analiz alanını tanımlayın. Telopa'daki bölümlere bakın, oryantasyonu ve dikişleri tanımlamak için dört X.
Koronal sütür tanımlayın ve bir tarafta uzun kemik yüzeyi tanımlamak, ve sonra diğer kısa yüzey. 40X büyütme altında, koronal sütür tanımlayın ve uzun yüzey boyunca, dikiş uzak iki veya üç optik alanları hareket ettirin. Analiz için bu alanın görüntüsünü yakalayın.
Kemiğin yapısal bütünlüğünü analiz etmek için görüntü yazılımı kullanabilirsiniz. Hemicalvarianın kalınlığı ve kemik bölgesi için kantitatif histomorfometrik analiz yapılabilir. Doğru kalvari analizi, tutarlı histolojik sonuçlar için iyi bir katıştırma ve uygun oryantasyona bağlıdır.
Deneysel durum başına en az üç calvaria kullandığınızdan emin olun. Burada kemiğin yapısını görebiliyoruz. Turuncuda kemik gözlenir.
Ayrıca periost, ostosit, endosteum ve kemiğin başka bir bölümünün varlığını da görebiliriz. Bizim durumumuzda, biz kemik remodeling artırmak için insülin kullanın. Bir kontrol le karşılaştırıldığında, kemik bölgesinde önemli bir artış görebiliriz.
Burada MDA-MB-231 hücre hattının model kalvaria üzerindeki etkisini görebiliriz. Biz görebilirsiniz, kontrol ile karşılaştırıldığında, kanser hücrelerinin varlığı kemik yıkımını teşvik osteolitik faktörlere neden. Biz kanser hücresi ve histoloji ile co-kültürler tarafından kemik rejenerasyonu ve kanser hücre-kemik etkileşimlerini ölçmek için calvaria modeli kullanılır.
Ayrıca verilerimizi nicel gerçek zamanlı PCR ile de doğrularız. Bu ex vivo modeli, üç boyutlu organizasyon ve kemiğin hücresel çeşitliliği korunur gibi birçok avantajı vardır, ve deneysel koşullar kontrol edilebilir. Ayrıca, model basit, kısa bir süre içinde sonuçları görebilirsiniz, ve düşük maliyetli.
Ve diğer tekniklerle kombine edilebilir, kantitatif gerçek zamanlı PCR, mikroskopi ve mikro-BT gibi.
