Lo scopo di questa procedura è quello di avere un modello ex vivo per valutare il rimodellamento osseo e ricreare il microambiente tumorale-osseo utilizzando la coltura calvaria o la co-coltura con cellule tumorali. La maggior parte della tecnica calvaria è un sistema di coltura di organi che utilizza ossa di calvaria di topi neonatali per valutare il rimodellamento osseo. Si può testare il potenziale terapeutico di diverse molecole, o addirittura ricreare il microambiente osseo-tumorale quando si usano co-colture con cellule tumorali.
Tutto questo in un saggio semplice e facile in breve tempo e a basso costo. Lo scopo di questa tecnica è quello di avere uno strumento per valutare la rigenerazione ossea nel microambiente osseo tumorale, utilizzando un modello ex vivo di coltura dell'organo calvariale del topo. Per prima cosa, seleziona un cucciolo di topo e posizionalo sotto il cofano.
Usiamo calvaria da cuccioli di topo di cinque-sette giorni. Prendi la testa con la siringa, taglia la pelle e libera l'area del cuoio capelluto abbastanza da sezionare la calvaria. Identificare le suture del cranio, sagittale, coronale e lambdoidi.
Fai un taglio dritto lungo le suture lambdoidi, a circa il livello dell'occhio. Tagliare su ciascun lato, dalle suture lambdoidi verso la sutura coronale. Con un angolo di 45, fare un altro taglio per collegare l'estremità del taglio realizzato con il taglio della fontanella anteriore.
È estremamente importante definire le suture cranica, sagittale, frontale, coronale, lambdoide, per garantire la corretta inclusione tissutale e l'analisi istologico. Con punte sottili forza, rimuovere la calvaria e metterla su una copertura della piastra di Petri. Con un bisturi, fai un taglio dritto dalla fontanella posteriore lungo la sutura sagittale attraverso la sutura coronale.
Si ottengono due emicalvarias. Raccogli ogni calvaria con le forcep e mettile in una nuova piastra di Petri con PBS. Per la coltura, posizionare l'emicalvaria in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti, contenente un millilitro di mezzo, e incubare per 24 ore a 37 gradi.
Possiamo anche usare colture calvariali primarie per riprodurre il microambiente tumorale-osseo per il riassorbimento osseo. Per fare questo, co-coltimo le calvarias con cellule tumorali, o con mezzi condizionati da cellule tumorali. 24 ore dopo, rimuovere il supporto e sostituirlo con supporti contenenti il trattamento che si desidera testare.
Se si desidera valutare le cellule tumorali e le interazioni ossee, o ricreare il microambiente tumorale-osseo, passare la calvaria a una piastra di attacco cellulare bassa, per evitare l'attaccamento delle cellule tumorali alla piastra. Tripinare le cellule tumorali, contarle e posizionarle con attenzione nella parte superiore dell'emicalvaria. È inoltre possibile utilizzare supporti condizionali provenienti da cellule tumorali e utilizzarli per incubare l'emicalvaria.
Incubare per sei-sette giorni a 37 gradi, con il 5% di CO2. Il terzo giorno, cambia i media e continua a incubare. Il numero di cellule che usano nella co-coltura dipende dalla linea cellulare del cancro.
È necessario, in primo luogo, ottimizzare il numero di celle necessarie per indurre una risposta in quella. Dopo la cultura, la calvaria passa attraverso un processo di fissazione, decalcificazione e paraffina incorporata. Inoltre, i tessuti sono sessati in un microtomo, macchiato e viene eseguita un'analisi istomorfometrica.
L'inclusione della calvaria può essere complicata. Per assicurarsi che il tessuto sia protetto durante l'inclusione, è possibile mettere il tessuto tra le spugne o utilizzare una carta velina o altra carta assorbente prima di metterlo nella cassetta. Per la lavorazione dei tessuti, avvolgere l'emicalvaria in carta velina.
Quindi, posizionarlo in una cassetta di incorporamento e fissare in buffer neutro in formalina, per 24 ore a quattro gradi. Per decalcificare la calvaria, posizionare la cassetta in un EDTA al 10% per 48 ore a quattro gradi. Elaborare le cassette tissutali con l'emicalvaria in un processore automatico dei tessuti.
Seguire un normale ciclo di rotazione giornaliera, quindi, includere nella paraffina. Per la sessatura, tagliare quattro sezioni microtiche con un microtomo, montare le sezioni su vetrini al microscopio e macchiare con ematossilina, eosina. L'analisi istologia è stata utilizzata per eseguire analisi quantitative della superficie ossea e delle aree di rimodellamento osseo.
Le immagini della calvaria nei sette giorni sono state analizzate utilizzando il software di imaging. Per la valutazione quantitativa, in primo luogo, definire l'area per l'analisi. Guarda nelle sezioni della telopa dove quattro X per identificare l'orientamento e le suture.
Definire la sutura coronale e identificare la lunga superficie ossea su un lato, e quindi la superficie corta dall'altro. Sotto l'ingrandimento 40X, identificare la sutura coronale e spostare due o tre campi ottici lontano dalla sutura, lungo la superficie lunga. Acquisire l'immagine di quest'area per l'analisi.
È possibile utilizzare il software di immagini per analizzare l'integrità strutturale dell'osso. Si può fare un'analisi istomorfometrica quantitativa per lo spessore e l'area ossea dell'emicalvaria. La corretta analisi della calvaria dipende da un buon incorporamento e da un corretto orientamento per risultati istologici coerenti.
Assicurati di usare almeno tre calvaria per condizione sperimentale. Qui, possiamo vedere la struttura dell'osso. In arancione, si osserva l'osso.
Possiamo anche vedere la presenza del periostio, dell'ostocita, dell'endosteo e di altre parti dell'osso. Nel nostro caso, usiamo l'insulina per aumentare il rimodellamento osseo. Rispetto a un controllo, possiamo vedere un aumento significativo dell'area ossea.
Qui, possiamo vedere l'effetto della linea cellulare MDA-MB-231 sul modello calvaria. Possiamo vedere, rispetto al controllo, che la presenza di cellule tumorali induce fattori osteolitici che stimolano la distruzione ossea. Abbiamo usato il modello calvaria per misurare la rigenerazione ossea e le interazioni cellule-ossa tumorali attraverso co-colture con cellule tumorali e istologia.
Convalidiamo anche i nostri dati tramite PCR quantitativa in tempo reale. Questo modello ex vivo ha molti vantaggi, come l'organizzazione tridimensionale e la diversità cellulare dell'osso sono preservati, e le condizioni sperimentali possono essere controllate. Inoltre, il modello è semplice, puoi vedere i risultati in un breve periodo di tempo ed è a basso costo.
E può essere combinato con altre tecniche, come PCR quantitativa in tempo reale, microscopia e micro-TC.
