מטרת הליך זה היא להיות מודל vivo לשעבר כדי להעריך את שיפוץ העצם ולשחזר את microenvironment עצם הגידול באמצעות תרבות קלבריה או שיתוף תרבות עם תאים סרטניים. רוב טכניקת calvaria היא מערכת תרבות איברים באמצעות עצמות calvaria מעכברים יילודים כדי להעריך את שיפוץ העצם. אתה יכול לבדוק את הפוטנציאל הטיפולי של מולקולות מגוונות, או אפילו לשחזר את microenvironment גידול העצם כאשר אתה משתמש בתרבויות שיתוף עם תאים סרטניים.
כל זה בהתראה פשוטה וקלה בזמן קצר ועלות נמוכה. מטרת טכניקה זו היא לקבל כלי להערכת התחדשות העצם ב microenvironment עצם סרטן, באמצעות מודל vivo לשעבר של תרבות איברים קלבריאליים העכבר. ראשית, בחר גור עכבר והצב אותו מתחת למכסה המנוע.
אנחנו משתמשים בגולגולתא מגורי עכברים בני חמישה עד שבעה ימים. קח את הראש עם המזרק, לחתוך את העור, ולנקה את אזור הקרקפת מספיק כדי לנתח את הקלבריה. זהה את התפרים של הגולגולת, קשת, קורונדל, ו lambdoids.
לעשות חתך ישר לאורך התפרים lambdoid, על רמת העין. חותכים מכל צד, מתפרים lambdoid לכיוון התפר קורונטל. ב 45 זווית, לעשות חתך נוסף כדי לחבר את הקצה של החתך עשה עם החתך של fontanel הקדמי.
חשוב מאוד להגדיר את תפרי הגולגולת, קשתית, פרונטלית, קורונאלית, lambdoid, כדי להבטיח את הכללת הרקמה הנכונה וניתוח היסטולוגיה. עם מדפים טיפים עדין, להסיר את calvaria, ולשים אותו על כיסוי צלחת פטרי. עם אזמל, לעשות חתך ישר מן fontanel האחורי לאורך התפר sagittal דרך התפר קורונאל.
שני hemicalvarias מתקבלים. הרם כל קלבריה עם המדפים, והצב אותם בצלחת פטרי חדשה עם PBS. לתרבות, מניחים את hemicalvaria בצלחת תרבות רקמות 24 באר, המכיל מיליליטר אחד של מדיה, ודגירה במשך 24 שעות ב 37 מעלות.
אנחנו יכולים גם להשתמש בתרבויות עגליות ראשוניות כדי לשחזר את microenvironment עצם הגידול עבור resorption העצם. כדי לעשות זאת, אנו שיתוף תרבות calvarias עם תאים סרטניים, או עם מדיה מותנה של תאים סרטניים. 24 שעות לאחר מכן, להסיר את המדיה ולהחליף אותו עם מדיה המכילה את הטיפול שאתה רוצה לבדוק.
אם ברצונך להעריך תאים סרטניים ואינטראקציות עצם, או לשחזר את microenvironment עצם הגידול, להעביר את calvaria לצלחת התקשרות הסלולר נמוך, כדי למנוע את ההחזקה של תאים סרטניים לצלחת. טריפסיניזציה של התאים הסרטניים, לספור אותם, ולמקם אותם בזהירות בחלק העליון של hemicalvaria. אתה יכול גם להשתמש במדיה מותנית מתאים סרטניים, ולהשתמש בו כדי להחפיר את hemicalvaria.
דגירה במשך שישה עד שבעה ימים ב 37 מעלות, עם חמישה אחוזים CO2. ביום השלישי, לשנות את התקשורת ולהמשיך דגירה. מספר התאים המשתמשים בתרבות השיתוף תלוי בקו התאי של הסרטן.
אתה צריך, תחילה, כדי למטב את מספר התאים הדרושים כדי לגרום לתגובה באחד. לאחר התרבות, הקלבריה עוברת תהליך של קיבעון, דקלציה ופרפין מוטבע. יתר על כן, הרקמות חתוכו במיקרוטום, מוכתמות, וניתוח היסטומורפי מבוצע.
הכללת הקלבריה יכולה להיות מסובכת. כדי לוודא כי הרקמה מוגנת במהלך ההכללה, אתה יכול לשים את הרקמה בין ספוגים או להשתמש בנייר טישו או נייר סופג אחר לפני לשים אותו בקלטת. לעיבוד רקמות, לעטוף את hemicalvaria בנייר טישו.
לאחר מכן, למקם אותו לתוך קלטת הטבעה, ולתקן במאגר ניטרלי בפורמלין, במשך 24 שעות בארבע מעלות. כדי לתקן את הקלבריה, הנח את הקלטת ב- 10%EDTA למשך 48 שעות בארבע מעלות. לעבד את קלטות הרקמה עם hemicalvaria במעבד רקמות אוטומטי.
בצע מחזור סיבוב יום רגיל, ולאחר מכן, כלול בפרפין. לצורך חתך, לחתוך ארבעה חלקים מיקרוטיים עם microtome, לעלות את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית, וכתם עם hematoxylin, אאוסין. ניתוח היסטולוגיה שימש לביצוע ניתוח כמותי של משטח העצם ושטחי שיפוץ העצמות.
התמונות של הקלבריה בשבעת הימים נותחו באמצעות תוכנת ההדמיה. עבור הערכה כמותית, ראשית, הגדר את האזור לניתוח. תסתכל בקטעים על הטלופה שבו ארבעה X כדי לזהות את האוריינטציה ואת התפרים.
הגדר את התפר התותח, וזהה את משטח העצם הארוך בצד אחד, ולאחר מכן את המשטח הקצר בצד השני. תחת ההגדלה 40X, לזהות את התפר הכתר ולהזיז שניים או שלושה שדות אופטיים מן התפר, לאורך פני השטח הארוכים. צלם את התמונה של אזור זה לצורך ניתוח.
אתה יכול להשתמש בתוכנת תמונות כדי לנתח את השלמות המבנית של העצם. ניתוח היסטומורפי כמותי לעובי ולאזור העצם של ההמיקלוואריה יכול להיעשות. ניתוח הקלבריה הנכון תלוי בהטבעה טובה ובכיוון הנכון לתוצאות היסטולוגיות עקביות.
הקפד להשתמש לפחות שלושה קלבריה לכל מצב ניסיוני. כאן, אנו יכולים לראות את מבנה העצם. בכתום, העצם נצפית.
אנחנו יכולים גם לראות את הנוכחות של periosteum, ostocyte, אנדוסטיום, וחלקים אחרים של העצם. במקרה שלנו, אנו משתמשים באינסולין כדי להגדיל את שיפוץ העצם. בהשוואה לשליטה, אנו יכולים לראות עלייה משמעותית באזור העצם.
כאן, אנו יכולים לראות את ההשפעה של קו תא מד"א-MB-231 על קלבריה מודל. אנו יכולים לראות, בהשוואה לשליטה, כי נוכחותם של תאים סרטניים לגרום גורמים osteolytic הממריצים הרס העצם. השתמשנו במודל קלבריה כדי למדוד התחדשות עצם ואינטראקציות סרטן בין עצם התא על ידי תרבויות שיתוף עם תאים סרטניים והיסטולוגיה.
אנו גם מאמתים את הנתונים שלנו לפי PCR כמותי בזמן אמת. למודל האקס ויוו הזה יש יתרונות רבים, כמו הארגון התלת מימדי והמגוון התאי של העצם נשמרים, ותנאים ניסיוניים יכולים להיות נשלטים. חוץ מזה, המודל הוא פשוט, אתה יכול לראות תוצאות בתקופה קצרה של זמן, וזה בעלות נמוכה.
וזה יכול להיות משולב עם טכניקות אחרות, כמו PCR כמותי בזמן אמת, מיקרוסקופיה, מיקרו-CT.
