يسمح أسلوبنا التصوير الدقيق للخلايا المناعية البشرية المتراكمة في الرئتين في ظروف التهابية الجسم الحي توفير رؤى مثيرة في عملية توجيه الرئة الخلية T. يدعم هذا البروتوكول البحوث الانتقالية على توجيه الرئة الخلية T وبالتالي قد يساعد في تحديد أهداف جديدة للعلاج الأمثل من الأمراض الرئوية الالتهابية أو التحسسية. على وجه الخصوص، والقدرة على النظر في تأثير خصائص الخلايا المناعية خاصة بالأمراض، وتنظيم الأنسجة الرئوية، والوسط الالتهابي على توجيه الرئة خلية T يجعل هذه الطريقة مفيدة للغاية.
عموما، لدينا تقنية ذات قيمة عالية للبحوث المناعية في مجال أمراض الرئة الالتهابية المزمنة، والتي غالبا ما تكون مدفوعة تراكم الأنسجة الساحقة من الخلايا المناعية المنشطة. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القدم في ما لا يقل عن 16 غرامًا ، ستة أسابيع ، تخدير C57 أسود ماوس 6J ، استخدم micropipet لتسليم 10 ميكرولترات ببطء من محلول باباين حديث الإعداد في أنف واحد من الفأر مرة واحدة في اليوم لمدة ثلاثة أيام متتالية. في اليوم التالي لإدارة الباباين الماضي ، طبقة 10 ملليلتر من Ficoll المتوسطة تحت الدم المحيطي البشري من متطوع صحي مخففة قبل نسبة واحد إلى اثنين في PBS لفصل التدرج الكثافة عن طريق الطرد المركزي.
نقل خلية الدم أحادية النية الطرفية أو طبقة PBMC interphase في أنبوب جديد 50 ملليلتر وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. بعد ذلك، قم بإجراء عزل ميكروبات مغناطيسي للخلايا الإيجابية CD4 وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. إعادة تعليق الخرز عزل CD4 الخلايا التائية الإيجابية في ما يصل إلى واحد مرات عشر إلى الخلايا التائية السابعة لكل ما لا يقل عن 500 ميكرولترات من تركيز برنامج تلفزيوني.
تسمية الخلايا مع ضوء أحمر مناسب صبغة الانتشار الخلايا مثير لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، اعتقال رد فعل وضع العلامات مع خمسة مجلدات من متوسطة RPMI تكملها 10٪ FBS لمدة خمس دقائق على الجليد تليها ثلاثة يغسل في المتوسط. لنقل بالتبني من الخلايا T CD4 الإنسان إيجابية في الفئران المتلقية البابين المكشوفة، إعادة تعليق الخلايا التائية المسمى fluorescently إلى مرة واحدة 10 إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر التركيز في برنامج تلفزيوني وتحميل 100 ميكرولتر من الخلايا في حقنة واحدة ملليلتر مجهزة إبرة 30 قياس لكل المتلقي، ثم حقن كامل حجم الخلايا من حقنة واحدة في الوريد الذي يعالج باباين الحفاظ على طرف إبرة داخل الوريد للحصول على إضافية خمس ثوان بعد تسليم الخلية لمنع تفريغ تعليق الخلية.
بعد ثلاث ساعات من نقل الخلايا بالتبني، ثقب البطين الأيمن لكل فأر القتل الرحيم مع قنية قياس 21 متصلة قسطرة وجعل شق في البطين الأيسر. اثقب الرئة ببطء مع 20 ملليلتر من الجليد البارد برنامج تلفزيوني تكملها خمسة ملليمولار EDTA تليها ملليلتر اثنين من الجليد البارد 4٪ شبهformaldehyde. عندما تم مسح كل من المثبت من خلال الأنسجة، وإزالة الغدد اللعابية وقطع العضلات الهنوية القصية للسماح ملقط أن تنزلق تحت القصبة الهوائية لفضح أنسجة الأنابيب الهوائية.
قم بإجراء ثقب أولي في القصبة الهوائية المكشوفة بإبرة من 30 مقياسًا قبل استبدال الإبرة بقسطرة حادة عيار 30 لمنع المزيد من الضرر في الأنسجة. استخدام حامل إبرة لختم تقاطع بين القسطرة إدراج والقصبة الهوائية، وملء بعناية الشعب الهوائية مع ما يقرب من 37 درجة مئوية 0.75٪ agarose حتى تتكشف كاملة من الرئة. يعد وجود تقاطع محكم بين القسطرة والقصبة الهوائية أمرًا بالغ الأهمية لتوسيع الرئة إلى حجمها الفسيولوجي والحفاظ على بنية الأنسجة للتصوير.
عندما تتوطد agarose تماما، وإزالة القسطرة ونقل بعناية الرئة إلى مظلمة، أنبوب مليلتر مملوءة 4٪ paraformaldehdye. بعد ذلك، تجفيف الأنسجة مع حضانات الإيثانول المتتابعة تحت التناوب المستمر في 31 دوران في الدقيقة وأربع درجات مئوية كما هو مبين لمدة أربع ساعات لكل حضانة. بعد الجفاف الكامل، نقل العينة إلى cinnamate الإيثيل لاحتضان ليلة وضحاها في درجة حرارة الغرفة حتى الأنسجة تظهر شفافة.
للحصول على مجهر الفلورسنت ورقة الضوء، استخدم قطرة صغيرة من الغراء مستقرة المذيبات العضوية لعصا الرئة إلى حامل العينة من المجهر وتعيين فص الرئة على حامل في وضع مستقيم. ضع حامل العينة في غرفته وحدد أشعة الليزر المناسبة للتجربة في برنامج الجهاز. بعد ذلك ، استخدم المتزلجون تحت Optics لتعيين عرض الورقة التي الفتحة العددية التي تكشف بشكل موحد عن الجهاز بأكمله أو قسم معين من الاهتمام.
استخدم شريط التمرير لتعيين شدة الليزر تحت التحكم في انتقال الليزر لكل ليزر محدد وانقر فوق تطبيق. استخدم إعدادات القياس المتقدمة لدمج أوراق الضوء اليمنى والأيسر لإنشاء صورة مضيئة بشكل متجانس. حدد مواضع البداية والنهاية للرصيف Z ليتم قياسها تحت نطاق المسح الضوئي وقم بتعيين حجم الخطوة إلى خمسة ميكرومترات ثم حدد الحفظ التلقائي لحفظ الملفات تلقائيًا وبدء القياس لالتقاط الصور.
عندما تم الحصول على جميع الصور، قم بتنشيط الزر تجاوز في برنامج تحليل ما بعد التصوير ثلاثي الأبعاد وقم بتحميل الصورة الأولى من مكدس Z واحد لبدء عملية إعادة البناء الافتتاحية والتلقائية ثلاثية الأبعاد لجميع الصور الأخرى للكومة Z المحددة، ثم تحت ضبط الشاشة، وضبط الكثافة، ومستوى اللون الأسود والتباين لكل قناة. لمقارنة تراكم الخلايا البشرية داخل الأنسجة الرئوية عبر عينات مختلفة، حدد تحرير والمحاصيل ثلاثية الأبعاد لتحديد مكعب الرئة بحجم معين. لتحديد عدد الخلايا المسماة داخل مكعب الرئة المحدد، افتح إضافة نقاط جديدة في شريط الأدوات، وانقر فوق تخطي الإنشاء التلقائي، وتحرير يدويًا، وحدد قناة 640 نانومتر.
تعيين مقياس نصف قطرها إلى 10.00 ميكرون، انقر فوق تحديد، وتحت تحرير، Shift انقر بزر الماوس الأيسر لوضع علامة على حدة كل خلية الفلوريسينغ مع نقطة. سيتم عرض العدد الإجمالي للخلايا التي تم حسابها في الإحصائيات. لالتقاط صورة، استخدم أداة اللقطة أو استخدم أداة الحركة لالتقاط فيديو.
ينتج عن تخصيب الخلايا المستندة إلى الميكروبات ووضع العلامات المفلورة اللاحقة كما هو موضح عادةً نقاءً إيجابيًا لـ CD4 بنسبة 95٪ على الأقل ووضع علامات ناجحة لهذه الخلايا على النحو المحدد من خلال عملية استئصال الخلايا المتدفقة. الإيثيل cinnamate الأنسجة المستندة إلى المقاصة يحقق مستوى عال من شفافية الجهاز مما يدل على نجاح معامل الانكسار مطابقة. توفر إشارة الفلورسنت التلقائية للأنسجة الرئوية أداة مفيدة لتصوير البنية التشريحية للرئة عن طريق المجهر ورقة الضوء التي يمكن عرضها كتوقع متوسط كثافة أو في الوضع السطحي.
مقارنة بالمجهر التقليدي، يقدم المجهر ورقة الضوء ميزة تصوير الجهاز كله وإعادة الإعمار 3D اللاحقة السماح لتحديد وتصور الانتشار صبغة التسمية، ونقل الخلايا التائية البشرية في سياق الجهاز كله، وعلاوة على ذلك، فإن تفضيل الخلايا التائية الإنسان المنقولة للتراكم الانتقائي داخل أنسجة الرئة الملتهبة من الحيوانات يتعرض باباين هو مدعوم كذلك من حقيقة أن الخلايا T CD4 الإيجابية لا يمكن استردادها من الغشاء المخاطي المعوي للحيوانات المتلقية. بالنسبة للكمية والمقارنة بين التراكم الرئوي للخلايا التائية الإيجابية CD4 البشرية بين الحالات المختلفة، يمكن أيضاً أن تحسب الخلايا المسماة في عدة مكعبات الرئة من الحجم المحدد كما هو موضح. إعداد الأنسجة بعناية بما في ذلك ضخ الرئة، والتضخم والأنسجة المقاصة مهم للغاية لجيل الأمثل من الصور المجهرية ورقة الضوء عالية الدقة.
لمزيد من تأكيد الانقسامات الناجحة للخلايا الليمفاوية البشرية المنقولة ، يمكن بسهولة الجمع بين هذا البروتوكول مع القياس الكمي التدفقي للخلايا الليمفاوية البشرية داخل لافراج المورين القصبي. القدرة على رصد الخلايا المناعية المستمدة من المرضى الفردية في ظروف الجسم الحي يدعم تحديد التعديلات الوظيفية في الخلايا المناعية مطبوعة بمرض معين أو العلاج.
